מיקרופוקוס X-ray CT (Microfocus) הדמיה של ההדמיה הסינית ( כיום) , וקסנוטורבלה ג'ניקה (קסנואקואלאמפין)
Summary
כאן, פרוטוקולים לביצוע מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה של שלושה חיות חסרי חוליות ימיים מוסברים בפרוטרוט. מחקר זה מתאר שלבים כגון קיבעון לדוגמה, כתמים, הרכבה, סריקה, שחזור תמונה, וניתוח נתונים. הצעות לגבי אופן ההתאמה של הפרוטוקול עבור דגימות שונות מסופקות גם כן.
Abstract
באופן מסורתי, ביולוגים נאלצו להסתמך על שיטות הרסניות כגון הסתמכות על מנת לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. שאינם הרסניים מיקרופוקוס רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (Microfocus) הדמיה הפכה לפרוטוקול עוצמה והמתעוררים בביולוגיה, בשל פיתוחים טכנולוגיים בשיטות מכתים לדוגמה וחידושים בחומרה Microfocus, עיבוד מחשבים, ונתונים תוכנות ניתוח. עם זאת, פרוטוקול זה אינו משמש בדרך כלל, כפי שהוא בשדות הרפואיים והתעשייתיים. אחת הסיבות לשימוש מוגבל זה היא העדר מדריך פשוט ומובן המכסה את כל השלבים הדרושים: אוסף לדוגמה, קיבעון, כתמים, הרכבה, סריקה, ניתוח נתונים. סיבה נוספת היא מגוון עצום של מטזואים, במיוחד חסרי חוליות ימיים. בגלל המידות המגוונות, המורפולוגיות והפיזיולוגיות, חיוני להתאים את התנאים הניסיוניים ותצורות החומרה בכל שלב, בהתאם למדגם. כאן, שיטות הדמיה microCT מוסברים בפירוט באמצעות שלושה שונים בעלי חוליות ים ימיים מגוונים: הפיניה שווה (האנטיתים, Cnidaria), Harmothoe Sp. (Polychaeta, אנאלאידה), ו xenoturbella יפני ( . קסנוטורסלדה, קסנאקומורפין הצעות על ביצוע הדמיה microCT על בעלי חיים שונים מסופקים גם.
Introduction
בדרך כלל, חוקרים ביולוגיים היו צריכים לעשות קטעים דקים ולבצע תצפיות על ידי מיקרוסקופ אור או אלקטרון כדי לחקור את המבנים הפנימיים של אורגניזמים אטומים. עם זאת, שיטות אלה הן הרסניות ובעייתיות כאשר הם מוחלים על יצורים נדירים או יקרי ערך. יתר על כן, מספר שלבים בשיטה, כגון הטבעה והפחתה, הם זמן רב, והוא יכול להימשך מספר ימים כדי להתבונן במדגם, בהתאם לפרוטוקול. יתר על כן, בעת טיפול בסעיפים רבים, תמיד יש אפשרות להזיק או לאבד חלקים מסוימים. טכניקות ניקוי רקמות זמינים עבור כמה דגימות1,2,3,4,5 אך אינם ישימים עדיין עבור מינים רבים של בעלי חיים.
כדי להתגבר על בעיות אלה, כמה ביולוגים החלו להשתמש microfocus רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (microfocus) הדמיה6,7,8,9,10,11, . 12,13,14,15 ב-X-ray CT, המדגם הוא הוקרן עם קרני רנטגן מזוויות שונות הנוצרות ממקור X-ray נע סביב המדגם, ואת הרנטגן המשודר מנוטרים על ידי גלאי כי גם נע סביב המדגם. נתוני שידור הרנטגן שהושגו מנתחים כדי לשחזר תמונות בחתך הרוחב של הדגימה. שיטה זו מאפשרת התבוננות של מבנים פנימיים ללא הרס של המדגם. בשל בטחונו וקלות, הוא משמש בדרך כלל ביישומים רפואיים ושיניים, וניתן למצוא מערכות CT בבתי חולים ובמרכזי שיניים ברחבי העולם. יתר על כן, רנטגן תעשייתי CT משמש לעתים קרובות להתבוננות בדגימות לא רפואי עבור בדיקה מטרולוגיה בתחום התעשייה. בניגוד CT רפואי, שבו המקור רנטגן וגלאי הם ניידים, שני החלקים הם קבועים CT תעשייתי, עם המדגם מסתובבת במהלך הסריקה. CT תעשייתי בדרך כלל מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר מאשר CT רפואי והוא המכונה microCT (ברמת מיקרומטר ברמה) או nanoCT (רזולוציה ברמת נאנמטר). לאחרונה, מחקר באמצעות microct גדל במהירות בתחומים שונים של ביולוגיה14,15,16,17,18,19, מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34.
מחקרים ביולוגיים באמצעות CT ממוקדות בתחילה מבנים פנימיים המורכבים בעיקר של רקמה קשה, כגון עצם. ההתקדמות טכניקות צביעת שימוש בחומרים כימיים שונים אפשרה ויזואליזציה של רקמות רכות באורגניזמים שונים6,7,8,9,14,15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , בת 24 , מיכל בן 25 , מיכל בן 26 , בן 27 , מיכל בן 28 , בן 29 , בן 30 , מיכל בן 31 , 32 , 33 , 34. של אלה ריאגנטים, מבוססי יוד סוכנים בניגוד הם בטוחים יחסית, זול, והוא יכול לשמש להדמיה של רקמות רכות באורגניזמים שונים7,14. בנוגע לחסרי חוליות ימיים, microct נעשה שימוש נרחב על בעלי חיים כגון רכיכות6,25,32,33, annelids18,19, מיכל בן 20 , 28, וארתוראופהלחמה21,23,29,31. עם זאת, היו דיווחים מעטים על החיה האחרת phyla, כמו bryozoans6, xenacoelomorphs26, ו קטריגרים24,30. באופן כללי, היו פחות מחקרים באמצעות microCT על חסרי חוליות ימיים מאשר אלה על בעלי חוליות. אחת הסיבות העיקריות לשימוש מוגבל זה על חסרי חוליות ימיים הוא מגוון עצום שנצפו בבעלי חיים אלה. בגלל הגדלים המגוונים, הורפולוגיות והפיזיולוגיות שלהם, כל מין מגיב בצורה שונה להליכים ניסיוניים שונים. לכן, זה הכרחי במהלך הכנת המדגם לבחור את הקיבעון המתאים ביותר והכתים מגיב, ולקבוע תנאים בכל שלב, מותאם לכל מין. באופן דומה, יש צורך גם להגדיר את תצורות הסריקה, כגון שיטת ההרכבה, מתח, זרם, שיעור מגדילה מכני, ואת עוצמת רזולוציית החלל, בהתאם לכל מדגם. כדי להתגבר על בעיה זו, מדריך פשוט ומובן המכסה את כל הצעדים הנחוצים, מסביר כיצד ניתן לכוונן כל שלב בהתאם לדגימה, ומציג דוגמאות מפורטות מדגימות מרובות.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים את פרוטוקול הדמיה microCT צעד אחר צעד, מתוך קיבעון דגימה לניתוח נתונים, באמצעות שלושה מינים חסרי חוליות ימיים. בסמוך לתחנה הביולוגית של מיססאקי, האוניברסיטה של טוקיו, נאספו דגימות של שושנת הים באקניה (אנתותים). היה להם גוף רך וכדורי שהיה בקוטר של 2 ס מ (איור 1A-C). Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) דגימות נאספו גם ליד תחנת מיססאקי ימית ביולוגית. הם היו תולעים דק שהיו כ 1.5 ס מ אורך, עם chaetae קשה הנוכחי לאורך כל הגוף (איור 1D). הדגימה של Xenoturbella35 (Xenoturbella, Xenacoeloma) מדגם נאסף ליד שימודה ימית מרכז המחקר, אוניברסיטת טסוקובה, במהלך ה -13 החוף jambio האורגניזם משותף סקר. הייתה זו תולעת עדינה שהייתה כ-0.8 ס מ אורך (איור 1E). התאמות שבוצעו עבור התנאים והתצורות של כל מדגם מוסברות בפרוטרוט. המחקר שלנו מספק מספר הצעות על איך לבצע הדמיה microCT על חסרי חוליות ימיים, ואנו מקווים כי זה יהיה השראה ביולוגים להשתמש בפרוטוקול זה עבור המחקר שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
תיקונים באמצעות פורמלין, כגון 10% (v/v) הפתרון של מי ים בשימוש במחקר זה, ידועים כדי לשמר את המבנה של חסרי חוליות מגוונות ימיים ומשמשים לעתים קרובות הדמיה microct18,24,25 ,26,28,30,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לתוספקו שירושי לעזרתו ולמתן את סביבת המחקר במהלך מחקר זה. אנו אסירי תודה לקנסוקה יאנאגי ולטקאל איזמי לקבלת ייעוץ בנוגע ל -A. זנב, ומסיוסו טנקה לקבלת ייעוץ בנוגע לדגימה . אנו מודים לצוות במרכז המחקר הימי של שימודה, באוניברסיטת טסוקובה ובתחנה הביולוגית של מיססאקי, אוניברסיטת טוקיו לעזרתם באוספי מדגם. אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית. עבודה זו נתמכת על ידי ה-JSPS גרנט בסיוע עבור מדענים צעירים (א) (JP26711022) ל-HN, ו-JAMBIO, האגודה היפנית לביולוגיה ימית.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
References
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist’s perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
- Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13 (2018).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
- Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
- Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
- Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
- Ziegler, A., Menze, B. H., Zander, J., Mosterman, P. J. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. , 233-260 (2013).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
- Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
- Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295 (2013).
- Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617 (2014).
- Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
- Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
- Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
- Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52 (2015).
- Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) – new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
- Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
- Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, &. #. 1. 9. 3. ;., Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941 (2016).
- Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245 (2017).
- Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
- Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
- Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158 (2018).
- Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
- Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107 (2018).
- Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
- Sasaki, T., Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. , 83-93 (2018).
- Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682 (2018).
- Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83 (2018).
- Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from ‘Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)’. figshare. , (2019).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
- Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781 (2008).
