Mikrofokus-Röntgen-CT (microCT) Bildgebung von Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) und Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)
Summary
Hier werden Protokolle zur Durchführung von Mikrofokus-Röntgentomographie (MicroCT) von drei marinen Wirbellosen-Tieren ausführlich erläutert. In dieser Studie werden Schritte wie Probenfixierung, Färbung, Montage, Scannen, Bildrekonstruktion und Datenanalysen beschrieben. Vorschläge, wie das Protokoll für verschiedene Samples angepasst werden kann, werden ebenfalls bereitgestellt.
Abstract
Traditionell mussten sich Biologen auf destruktive Methoden wie Dassektionen verlassen, um die inneren Strukturen undurchsichtiger Organismen zu untersuchen. Die zerstörungsfreie Mikrofokus-Röntgentomographie (MicroCT) ist aufgrund technologischer Fortschritte bei Probenfärbemethoden und Innovationen in MikroCT-Hardware, Verarbeitungscomputern und Daten zu einem leistungsfähigen und sich abzeichnenden Protokoll in der Biologie geworden. Analysesoftware. Dieses Protokoll wird jedoch nicht häufig verwendet, da es im medizinischen und industriellen Bereich ist. Einer der Gründe für diese eingeschränkte Nutzung ist das Fehlen eines einfachen und verständlichen Handbuchs, das alle notwendigen Schritte abdeckt: Probenentnahme, Fixierung, Färbung, Montage, Scannen und Datenanalysen. Ein weiterer Grund ist die große Vielfalt von Metazoen, insbesondere wirbellosen Meerestieren. Aufgrund der unterschiedlichen Größen, Morphologien und Physiologien von Marinewirbellosen ist es entscheidend, die experimentellen Bedingungen und Hardwarekonfigurationen bei jedem Schritt je nach Probe anzupassen. Hier werden mikroCT-Bildgebungsverfahren anhand von drei phylogenetisch unterschiedlichen wirbellosen Meereswirbeltieren ausführlich erklärt: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) und Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Vorschläge zur Durchführung von MikroCT-Aufnahmen an verschiedenen Tieren werden ebenfalls bereitgestellt.
Introduction
Biologische Forscher mussten in der Regel dünne Abschnitte machen und Beobachtungen mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie durchführen, um die inneren Strukturen undurchsichtiger Organismen zu untersuchen. Diese Methoden sind jedoch destruktiv und problematisch, wenn sie auf seltene oder wertvolle Exemplare angewendet werden. Darüber hinaus sind mehrere Schritte in der Methode, wie das Einbetten und Teilen, zeitaufwändig, und es kann mehrere Tage dauern, bis eine Probe beobachtet wird, je nach Protokoll. Darüber hinaus besteht bei der Handhabung zahlreicher Abschnitte immer die Möglichkeit, Teile zu beschädigen oder zu verlieren. Geweberäumtechniken sind für einige Exemplare1,2,3,4,5 verfügbar, aber noch nicht für viele Tierarten anwendbar.
Um diese Probleme zu überwinden, haben einige Biologen begonnen, Mikrofokus-Röntgen-Computertomographie (microCT) Bildgebung6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. In Der Röntgen-CT wird die Probe mit Röntgenstrahlen aus verschiedenen Winkeln bestrahlt, die aus einer Röntgenquelle erzeugt werden, die sich um die Probe bewegt, und die übertragenen Röntgenstrahlen werden von einem Detektor überwacht, der sich ebenfalls um die Probe bewegt. Die erhaltenen Röntgenübertragungsdaten werden analysiert, um Querschnittsbilder der Probe zu rekonstruieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung von internen Strukturen ohne Zerstörung der Probe. Aufgrund seiner Sicherheit und Leichtigkeit, Es wird häufig in medizinischen und zahnmedizinischen Anwendungen verwendet, und CT-Systeme können in Krankenhäusern und Zahnzentren weltweit gefunden werden. Darüber hinaus wird industrielle Röntgen-CT häufig zur Beobachtung nichtmedizinischer Proben zur Inspektion und Messtechnik im industriellen Bereich eingesetzt. Im Gegensatz zur medizinischen CT, bei der die Röntgenquelle und die Detektoren mobil sind, werden die beiden Teile in industriellem CT fixiert, wobei sich die Probe beim Scannen dreht. Industrielle CT produziert in der Regel Bilder mit höherer Auflösung als medizinische CT und wird als microCT (Micrometer-Level Resolution) oder nanoCT (Nanometer-Level-Auflösung) bezeichnet. In letzter Zeit hat die Forschung mit microCT in verschiedenen Bereichen der Biologie schnell zugenommen14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Biologische Studien mit CT zielten zunächst auf interne Strukturen ab, die hauptsächlich aus Hartem Gewebe bestehen, wie Knochen. Fortschritte in der Färbetechnik mit verschiedenen chemischen Mitteln ermöglicht die Visualisierung von Weichteilen in verschiedenen Organismen6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Von diesen Reagenzien sind Jod-basierte Kontrastmittel relativ sicher, kostengünstig und können zur Visualisierung von Weichgeweben in verschiedenenOrganismen7,14verwendet werden. In Bezug auf marine Wirbellose, microCT wurde weit verbreitet auf solche Tiere wie Weichtiere6,25,32,33, Annelids18,19, 20 , 28und Arthoropoden21,23,29,31. Es gab jedoch nur wenige Berichte über andere Tierphyla, wie bryozoans6, xenacoelomorphs26, und cnidarians24,30. Im Allgemeinen gab es weniger Studien mit MicroCT an wirbellosen Meerestieren als an Wirbeltieren. Ein Hauptgrund für diesen begrenzten Einsatz bei wirbellosen Meerestieren ist die große Vielfalt, die bei diesen Tieren beobachtet wird. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Größen, Morphologien und Physiologien reagiert jede Spezies unterschiedlich auf unterschiedliche experimentelle Verfahren. Daher ist es bei der Probenvorbereitung von entscheidender Bedeutung, das am besten geeignete Fixierungs- und Färbereagenz zu wählen und bei jedem Schritt die Bedingungen festzulegen, die für jede Art angepasst sind. Ebenso ist es notwendig, die Scankonfigurationen, wie z. B. Montagemethode, Spannung, Strom, mechanische Vergrößerungsrate und die Raumauflösungsleistung, für jede Probe entsprechend einzustellen. Um dieses Problem zu lösen, ist ein einfaches und verständliches Handbuch, das alle notwendigen Schritte abdeckt, erklärt, wie jeder Schritt je nach Probe angepasst werden kann, und detaillierte Beispiele aus mehreren Proben zeigt, ist unerlässlich.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir Schritt für Schritt das mikroCT-Bildgebungsprotokoll, von der Probenfixierung bis zur Datenanalyse unter Verwendung von drei marinen Wirbellosenarten. Exemplare der Seeanemone Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) wurden in der Nähe der Misaki Marine Biological Station, University of Tokyo, gesammelt. Sie hatten einen kugelförmigen, weichen Körper mit einem Durchmesser von etwa 2 cm (Abbildung1A-C). Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) Proben wurden auch in der Nähe der Misaki Marine Biological Station gesammelt. Es handelte sich um schlanke Würmer, die etwa 1,5 cm lang waren, mit zähen Chaetae am ganzen Körper (Abbildung1D). Ein Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) Wurde in der Nähe des Shimoda Marine Research Center, Universität Tsukuba, während der 13. JAMBIO Coastal Organism Joint Survey gesammelt. Es war ein weichköpfiger Wurm, der etwa 0,8 cm lang war (Abbildung 1E). Die Anpassungen für die Bedingungen und Konfigurationen der einzelnen Stichproben werden ausführlich erläutert. Unsere Studie enthält mehrere Vorschläge zur Durchführung von MikroCT-Aufnahmen an wirbellosen Meerestieren, und wir hoffen, dass sie Biologen dazu inspirieren wird, dieses Protokoll für ihre Forschung zu nutzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixative, die Formalin verwenden, wie die 10% (v/v) Formalinlösung in Meerwasser, die in dieser Studie verwendet wird, sind dafür bekannt, die Morphologie verschiedener mariner Wirbellose zu erhalten und werden häufig für MikroCT-Bildgebung verwendet18,24,25 ,26,28,30,33. Allerdings sin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Toshihiko Shiroishi für seine Unterstützung und für die Bereitstellung des Forschungsumfelds während dieser Studie. Wir danken Kensuke Yanagi und Takato Izumi für Ihre Beratung zu A. equinaund Masaatsu Tanaka für Ihre Beratung zum Harmothoe sp. Exemplar. Wir danken den Mitarbeitern des Shimoda Marine Research Center, der Universität Tsukuba und der Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo für ihre Hilfe bei den Probensammlungen. Wir danken Editage (www.editage.jp) für die Englischsprachige Bearbeitung. Diese Arbeit wurde vom JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) an HN und JAMBIO, Japanese Association for Marine Biology, unterstützt.
Materials
| 250-ml Erlenmeyer flask | Corning | CLS430183 | |
| 5-ml Sampling tube ST-500 | BIO-BIK | 103010 | |
| 50-ml Polypropylene tube | Greiner Bio One International | 227261 | |
| 60-mm Non-treated Dish | IWAKI | 1010-060 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Ecological grade tip (blue) 1000 µl | BMBio | BIO1000RF | |
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | 057-00451 | |
| Formalin | Wako Pure Chemical Industries | 061-00416 | |
| Iodine | Wako Pure Chemical Industries | 094-05421 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| OsiriX DICOM Viewer | Pixmeo SARL | OsiriX MD v10.0 | https://www.osirix-viewer.com |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 163-25983 | |
| Petiolate needle | AS ONE | 2-013-01 | |
| Pipetman P200 Micropipette | GILSON | F123601 | |
| Pipetman P1000 Micropipette | GILSON | F123602 | |
| Potassium iodide | Wako Pure Chemical Industries | 166-03971 | |
| Precision tweezers 5 | DUMONT | 0302-5-PS | |
| QuickRack MultI fit tip (yellow) 200 ul | Sorenson | 10660 | |
| Razor blades | Feather | FA-10 | |
| Ring tweezers | NAPOX | A-26 | |
| Stereoscopic microscope | Leica | MZ95 | |
| X-ray Micro-CT imaging system | Comscantechno | ScanXmate-E090S105 |
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