Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta
Summary
El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.
Abstract
La naturaleza multitrófica de los estudios de expresión génica de herbívoros de insectos exige un gran número de réplicas biológicas, creando la necesidad de protocolos herbáricos más simples y simplificados. Las perturbaciones de los insectos masticadores generalmente se estudian en sistemas vegetales enteros. Si bien esta estrategia de todo el organismo es popular, no es necesario si observaciones similares se pueden replicar en una sola hoja separada. La suposición es que los elementos básicos necesarios para la transducción de la señal están presentes dentro de la propia hoja. En el caso de los primeros acontecimientos en la transducción de la señal, las células sólo necesitan recibir la señal de la perturbación y transmitir esa señal a las células vecinas que se ensayan para la expresión génica.
El método propuesto simplemente cambia el momento del desprendimiento. En experimentos con plantas enteras, las larvas se limitan a una sola hoja que finalmente se separa de la planta y se ensaya para la expresión génica. Si se invierte el orden de la escisión, desde el último en estudios de plantas enteras, hasta el primero en el estudio separado, se simplifica el experimento de alimentación.
Kennebec se propaga por transferencia nodal en un medio de cultivo de tejido simple y se transfiere al suelo para un mayor crecimiento si se desea. Las hojas se extircan de la planta madre y se trasladan a los platos de Petri donde el ensayo de alimentación se lleva a cabo con las etapas larvales de M. sexta. El tejido de la hoja dañado se ensaya para la expresión de eventos relativamente tempranos en la transducción de la señal. El análisis de la expresión génica identificó factores de transcripción Cys2-His2 (C2H2) específicos de la infestación, lo que confirma el éxito del uso de hojas desasociadas en estudios de respuesta temprana. El método es más fácil de realizar que las infestaciones de plantas enteras y utiliza menos espacio.
Introduction
Herbivory pone en marcha una serie de eventos moleculares durante los cuales una planta puede identificar el ataque y montar una respuesta apropiada para su supervivencia. Una planta recibe dos señales básicas de los insectos masticadores; uno por el daño físico al tejido y el otro a partir de sustancias específicas de insectos. Los patrones moleculares asociados al daño (DamP) se liberan en respuesta al daño creado por las partes bucales larvales y desencadenan una respuesta de herida bien definida que resulta en un aumento de la hormona ácido jasmónico y la transcripción de los genes de defensa1. Uno de los DamPs más conocidos es systemin, un polipéptido que se forma por el escote de la proteína prosystemin más grande después de que una hoja es herida2,3. La respuesta de la herida de ácido jasmónico se modula aún más por patrones moleculares asociados a herbívoros (HAMPs), que pueden derivarse de saliva de oruga, contenido intestinal (regurgitante) y heces (frass)4. Los insectos utilizan estas sustancias para aumentar o evadir la respuesta de defensa5. Los factores de transcripción transmiten el mensaje de las señales hormonales en la respuesta de defensa a través de la regulación de los genes de defensa aguas abajo6,7,8.
Algunos estudios de interacción entre plantas y insectos utilizados en entornos de laboratorio son del tipo simulado, con el objetivo de aproximar el método natural de alimentación por el insecto. El herbívoro simulado generalmente se logra mediante la creación de daño artificial a los tejidos vegetales con varias herramientas que imitan el mecanismo específico de las partes bucales de insectos suficientes para causar la liberación de DAPP y desencadenar la producción de genes de defensa. Otros componentes específicos de insectos como las secreciones orales o regurgitante a menudo se añaden para replicar la contribución de los HAMPs9,10,11. La creación de un tamaño y tipo específico de herida y la aplicación de cantidades precisas de HAMPs es una ventaja para este tipo de estudios y puede ofrecer resultados más reproducibles. Los estudios herbívoros naturales, donde el daño al tejido vegetal se logra mediante la aplicación de insectos adquiridos en el campo o criados en laboratorio, a menudo son más difíciles porque el tamaño de la herida y las cantidades de HAMP se rigen por el comportamiento de los insectos y añaden variabilidad a la Datos. Los métodos naturales versus simulados y sus ventajas y desventajas están bien debatidas en la literatura12,13,14.
Para estudiar los primeros eventos de señalización, como los factores de transcripción, se debe consumir un cierto porcentaje de la hoja en un período relativamente corto de tiempo, por lo que las larvas deben comenzar a masticar inmediatamente y mantener el consumo hasta que la hoja se congele para su análisis. M. sexta es un alimentador voraz en múltiples plantas solanaceous durante muchas de sus etapas larvales, por lo que es ideal para impartir el máximo daño en un período relativamente corto de tiempo15. Esto es conveniente cuando se estudian los primeros eventos de señalización, ya que la respuesta de la planta ocurre casi inmediatamente después de que un insecto entra en contacto con la superficie de la hoja16,17. El método de contención de jaulas de clip comúnmente utilizado resulta torpe, ya que varias jaulas requerirían ajustes continuos a lo largo del experimento para permitir la eliminación o adición de larvas. Las hojas también deben ser lo suficientemente grandes y fuertes como para soportar la alimentación de múltiples insectos al mismo tiempo. Estos tipos de plantas de patata requieren una gran cantidad de espacio para observar la alimentación. Las larvas a menudo se reubican en la parte inferior de la superficie de la hoja, lo que también hace que las observaciones de alimentación sean bastante difíciles. El uso de plantas enteras para realizar estos experimentos es claramente engorroso.
El estudio actual utiliza hojas desprendidas aisladas en platos Petri en lugar de plantas enteras para agilizar y simplificar todo el enfoque vegetal para estudiar el herbívoro. La aplicación del protocolo en este estudio se limita a la observación de un grupo de factores de transcripción C2H2 inducidos temprano en las hojas de patata después del daño herbívoro por M. sexta larvas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de metodologías herbáceas de plantas enteras existentes no es necesario para lograr el objetivo de este estudio en particular (es decir, examinar un conjunto de genes candidatos para su respuesta a la infestación). El beneficio obvio del refinamiento de la hoja separada es acortar el tiempo que se tarda en realizar ensayos herbívoros. La naturaleza difícil de controlar de plantas enteras con jaulas de clip se elimina y los ensayos se realizan antes, ya que las plantas de tan solo 2 semanas se pueden utilizar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer a Bob Farrar y Alexis Park por proporcionar insectos utilizados en este estudio y por su experiencia en la puesta en escena larval. Gracias adicionales a Michael Blackburn y Saikat Ghosh por la revisión crítica del manuscrito.
La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.
USDA es un Proveedor y Empleador de Igualdad de Oportunidades.
Materials
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
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