Summary

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

Published: May 15, 2019
doi:

Summary

Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Abstract

Die multitrophische Natur von Genexpressionsstudien von Insektenkraut erfordert eine große Anzahl biologischer Replizieren, wodurch einfachere, schlankere Kräuterschutzprotokolle erforderlich sind. Störungen von Kauinsekten werden in der Regel in ganzen Pflanzensystemen untersucht. Während diese ganze Organismus-Strategie beliebt ist, ist es nicht notwendig, wenn ähnliche Beobachtungen in einem einzigen abgetrennten Blatt repliziert werden können. Es wird davon ausgegangen, dass die für die Signaltransduktion erforderlichen Grundelemente innerhalb des Blattes selbst vorhanden sind. Bei frühen Ereignissen in der Signaltransduktion müssen Zellen nur das Signal von der Störung empfangen und an benachbarte Zellen übertragen, die auf Genexpression untersucht werden.

Die vorgeschlagene Methode ändert lediglich den Zeitpunkt der Ablösung. In ganzen Pflanzenexperimenten sind Larven auf ein einzelnes Blatt beschränkt, das schließlich von der Pflanze gelöst und auf Genexpression untersucht wird. Wenn die Reihenfolge der Exzision umgekehrt wird, von der letzten in ganzen Pflanzenstudien, auf den ersten in der freistehenden Studie, wird das Fütterungsexperiment vereinfacht.

Solanum tuberosum var. Kennebec wird durch Knotentransfer in einem einfachen Gewebekulturmedium vermehrt und auf Wunsch auf den Boden übertragen. Die Blätter werden von der Mutterpflanze entfernt und in Petrischalen verlegt, wo der Fütterungstest mit den Larvenstadien von M. sextadurchgeführt wird. Beschädigtes Blattgewebe wird auf die Expression relativ früher Ereignisse in der Signaltransduktion geprüft. Die Genexpressionsanalyse identifizierte befallspezifische Cys2-His2 (C2H2)-Transkriptionsfaktoren, was den Erfolg der Verwendung von freistehenden Blättern in frühen Reaktionsstudien bestätigte. Die Methode ist einfacher durchzuführen als ganze Pflanzenbefall und verbraucht weniger Platz.

Introduction

Herbivory setzt eine Reihe molekularer Ereignisse in Gang, bei denen eine Pflanze sowohl den Angriff identifizieren als auch eine angemessene Reaktion auf ihr Überleben montieren kann. Eine Pflanze erhält zwei grundlegende Hinweise von kauenden Insekten; eine durch die physische Schädigung des Gewebes und die andere durch insektenspezifische Substanzen. Schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) werden als Reaktion auf Schäden freigesetzt, die durch Larvenmspiele verursacht werden, und lösen eine klar definierte Wundreaktion aus, die zu einer Erhöhung des Hormons Jasmonsäure und der Transkription der Verteidigungsgene1führt. Eines der bekanntesten DAMPs ist systemin, ein Polypeptid, das durch die Spaltung des größeren Prosystemin-Proteins gebildet wird, nachdem ein Blatt 2,3verwundet wurde. Die Jasmonsäure-Wundreaktion wird durch pflanzenfressende molekulare Muster (HAMPs) weiter moduliert, die aus Raupenspeichel, Darminhalt (regurgitant) und Kot (frass) abgeleitet werden können4. Insekten verwenden diese Substanzen, um entweder die Abwehrzuwehr zu steigern oder zu umgehen5. Transkriptionsfaktoren leiten dann die Botschaft von Hormonsignalen in der Abwehrreaktion über die Regulierung der nachgeschalteten Abwehrgene6,7,8weiter.

Einige Pflanzen-Insekten-Interaktionsstudien, die in Laborumgebungen verwendet werden, sind vom simulierten Typ, mit dem Ziel, die natürliche Methode der Fütterung durch das Insekt zu annähernden. Simuliertes Krautwird wird in der Regel durch die Schaffung künstlicher Schäden an Pflanzengeweben mit verschiedenen Werkzeugen erreicht, die den spezifischen Mechanismus von Insektenmundteilen imitieren, die ausreichen, um die Freisetzung von DAMPs zu verursachen und die Produktion von Verteidigungsgenen auszulösen. Andere insektenspezifische Komponenten wie mundende Sekrete oder Regurgitant werden oft hinzugefügt, um den Beitrag von HAMPs9,10,11zu replizieren. Die Erstellung einer bestimmten Größe und Art der Wunde und die Anwendung präziser Mengen an HAMPs ist ein Vorteil für diese Arten von Studien und kann reproduzierbarere Ergebnisse liefern. Natürliche Pflanzenschutzstudien, bei denen Schäden am Pflanzengewebe durch die Anwendung von felderworbenen oder im Labor gezüchteten Insekten durchgeführt werden, sind oft schwieriger, da Wundgrößen- und HAMP-Mengen durch Insektenverhalten bestimmt werden und die Variabilität der daten. Die natürlichen versus simulierten Methoden und ihre Vor- und Nachteile sind in der Literatur gut diskutiert12,13,14.

Um frühe Signalereignisse wie Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, muss ein bestimmter Prozentsatz des Blattes in relativ kurzer Zeit verbraucht werden, so dass Larven sofort zu kauen beginnen und den Verbrauch aufrecht erhalten müssen, bis das Blatt zur Analyse eingefroren ist. M. sexta ist ein gefräßiger Feeder auf mehreren solanaceous Pflanzen während vieler seiner Larvenstadien, so dass es ideal für die Vermittlung von maximalen Schaden in einer relativ kurzen Zeit15. Dies ist praktisch, wenn frühe Signalereignisse untersucht werden, da die Reaktion der Pflanze fast unmittelbar nach einem Insektenkontakt mit der Blattoberfläche16,17auftritt. Die häufig verwendete Clip-Käfig-Methode der Einschließung erweist sich als ungeschickt, da mehrere Käfige während des gesamten Experiments kontinuierliche Anpassungen erfordern würden, um die Entfernung oder Zugabe von Larven zu ermöglichen. Die Blätter müssen auch groß genug und stark genug sein, um mehrere Insekten zu unterstützen, die gleichzeitig füttern. Diese Arten von Kartoffelpflanzen benötigen viel Platz, um die Fütterung zu beobachten. Larven werden oft an die Unterseite der Blattoberfläche verlagert, was auch Fütterungsbeobachtungen recht schwierig macht. Ganze Pflanzen zu verwenden, um diese Experimente durchzuführen, ist eindeutig umständlich.

Die aktuelle Studie verwendet freistehende Blätter, die in Petrischalen isoliert sind, anstatt ganze Pflanzen, um den gesamten Pflanzenansatz für das Studium von Kräutern zu rationalisieren und zu vereinfachen. Die Anwendung des Protokolls in dieser Studie beschränkt sich auf die Beobachtung einer Gruppe von C2H2-Transkriptionsfaktoren, die früh in Kartoffelblättern nach pflanzenfressenden Schäden durch M. sexta Larven induziert wurden.

Protocol

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für eine Person zum Einrichten, Erfassen von Beobachtungen und Sammeln von Proben konzipiert. Mehrere Durchläufe desselben Setups können kombiniert werden, um die biologische Replikation zu erhöhen. Alle zusätzlichen Wiederholungen des Experiments sollten zur gleichen Tageszeit eingerichtet werden, um mögliche tagtägliche Einflüsse auf die Genexpression zu beseitigen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass 3 “befallene” Blätter für 5 separate Erntezeitpunkte erstellt werden. A…

Representative Results

Der Blattverbrauch definiert den Erfolg des Protokolls. Gesunde, genau inszenierte Larven sollten sofort nach der Platzierung auf der Blattoberfläche mit der Fütterung beginnen und die Fütterung sollte während der Befallzeit ziemlich konsistent fortgesetzt werden. In Video 1beginnt die Larve an der Spitze sofort nach der Platzierung zu kauen und hält eine konstante Rate während der Fütterung. Dies ist besonders wichtig, wenn frühe Genexpressionsereignisse nach dem…

Discussion

Die Verwendung bestehender Methoden für pflanzenkräuterelfenbeinte Pflanzen ist nicht erforderlich, um das Ziel dieser speziellen Studie zu erreichen (d. h. eine Reihe von Kandidatengenen auf ihre Reaktion auf Densonfall zu untersuchen). Der offensichtliche Vorteil der losgelösten Blattverfeinerung ist die Verkürzung der Zeit, die es braucht, um Kräuter-Assays durchzuführen. Die sperrige Natur ganzer Pflanzen mit Clipkäfigen wird eliminiert und Tests werden früher durchgeführt, da Pflanzen, die noch 2 Wochen alt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Bob Farrar und Alexis Park für die Bereitstellung von Insekten, die in dieser Studie verwendet werden, und für ihre Expertise in der Larveninszenierung. Weiterer Dank an Michael Blackburn und Saikat Ghosh für die kritische Überprüfung des Manuskripts.

Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und impliziert keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium.

USDA ist Ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber.

Materials

agar substitute PhytoTechnology Laboratories G3251 product is Gelzan
containment vessel (6,12 or 24 well dish) Fisher Scientific  08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 many other companies sell these products
manduca eggs  Carolina Biological Supply Company 143880 30-50 eggs
manduca eggs  Great Lakes Hornworm NA 50, 100, 250 or 500 eggs
manduca larvae Carolina Biological Supply Company call for specific larval instar requests any instar
manduca larvae Great Lakes Hornworm call for specific larval instar requests any instar
microcentrifuge tubes, 1.7 ml  Thomas Scientific 1158R22 these have been tested in liquid N2 and will not explode
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins PhytoTechnology Laboratories M519 used to make propagation medium
nutrient agar mix PhytoTechnology Laboratories M5825 product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan
paper filter discs Fisher Scientific  09-805A Whatman circles-purchase to fit in petri dish
petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm Fisher Scientific  FB0875713A or FB0875712 purchase size appropriate for leaf size
potato tubers  any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
pots, 10"  Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 41PT1000CN2
preservative/biocide Plant Cell Technology NA product is PPM (Plant Preservative Mixture)
seed potatoes for explant source any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
slow release fertilizer (14-14-14 ) any NA Osmocote is a popular brand name
soft touch forceps BioQuip 4750
soil mix Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 65-51121 product is Sunshine LC1 mix
sterile culture vessel  PhytoTechnology Laboratories C2100 Magenta-type vessel, PTL-100
sterile culture vessel  Fisher Scientific  ICN2672206 product is MP Biomedicals Plantcon

References

  1. Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
  2. Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
  3. Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
  4. Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
  5. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
  6. Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
  7. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
  8. War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
  9. McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
  10. Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
  11. Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
  12. Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
  13. Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
  14. Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
  15. Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
  16. Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
  17. Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
  18. Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
  19. Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
  20. Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
  21. Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
  22. Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
  23. Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
  24. Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
  25. Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
  26. Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
  27. Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
  28. Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
  29. Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
  30. Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
  31. Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
  32. Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
  33. Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
  34. Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
  35. Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
  36. Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
  37. Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
  38. . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
  39. . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
  40. . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
  41. . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
  42. Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).

Play Video

Cite This Article
Novak, N. G., Perez, F. G., Jones, R. W., Lawrence, S. D. Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta. J. Vis. Exp. (147), e59153, doi:10.3791/59153 (2019).

View Video