Summary

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

Published: May 15, 2019
doi:

Summary

O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.

Abstract

A natureza multitrófica dos estudos de expressão gênica de insetos herbívoros exige um grande número de repetições biológicas, criando a necessidade de protocolos herbívoros mais simples e simplificados. As perturbações dos insetos mastigatórios são geralmente estudadas em sistemas de plantas inteiras. Embora toda essa estratégia de organismo seja popular, não é necessário que observações semelhantes possam ser replicadas em uma única folha destacada. A suposição é que os elementos básicos exigidos para a transdução de sinal estão atuais dentro da folha própria. No caso de eventos precoces na transdução de sinal, as células precisam apenas receber o sinal da perturbação e transmitir esse sinal para as células vizinhas que são ensaiadas para a expressão gênica.

O método proposto simplesmente muda o tempo do destacamento. Em experimentos de plantas inteiras, as larvas são confinadas a uma única folha que é eventualmente separada da planta e ensaiada para a expressão gênica. Se a ordem da excisão é invertida, do último em estudos inteiros da planta, a primeiramente no estudo destacado, o experimento de alimentação é simplificado.

Solanum tuberosum var. Kennebec é propagado por transferência nodal em um meio de cultura simples do tecido e transferido ao solo para um crescimento mais adicional se desejado. As folhas são excisadas da planta-mãe e relocalizadas para placas de Petri onde o ensaio de alimentação é conduzido com os estágios larvares de M. sexta. O tecido foliar danificado é analisado para a expressão de eventos relativamente precoces na transdução de sinal. A análise da expressão gênica identificou fatores de transcrição Cys2-His2 (C2H2) específicos da infestação, confirmando o sucesso do uso de folhas destacadas em estudos de resposta precoce. O método é mais fácil de executar do que as infestações inteiras da planta e usa menos espaço.

Introduction

Herbívoros define em movimento uma série de eventos moleculares durante os quais uma planta pode identificar o ataque e montar uma resposta adequada para a sua sobrevivência. Uma planta recebe duas pistas básicas de insetos mastigadores; um dos danos físicos ao tecido e o outro a partir de substâncias específicas de insetos. Os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) são liberados em resposta a danos criados por bocais larvares e desencadeiam uma resposta de ferida bem definida que resulta em um aumento no ácido jasmonico hormonal e na transcrição dos genes de defesa1. Um dos Damps mais conhecidos é systemin, um polipeptídeo que é formado pela clivagem da proteína prosystemin maior depois que uma folha é ferida2,3. A resposta da ferida do ácido jasmônico é modulada mais por testes padrões moleculars-associados HERBIVORE (hamps), que podem ser derivados da saliva da lagarta, dos índices do intestino (regurgitant) e das fezes (Frass)4. Os insetos usam essas substâncias para impulsionar ou evadir a resposta de defesa5. Os fatores de transcrição então retransmitem a mensagem dos sinais hormonais na resposta de defesa via regulação dos genes de defesa a jusante6,7,8.

Alguns estudos de interação planta-inseto utilizados em configurações laboratoriais são do tipo simulado, com o objetivo de aproximar o método natural de alimentação pelo inseto. A herbívoria simulada é geralmente realizada através da criação de danos artificiais em tecidos vegetais com várias ferramentas que imitam o mecanismo específico de bocais de insetos suficientes para causar a liberação de DAMPs e desencadear a produção de genes de defesa. Outros componentes específicos do inseto, como secreções orais ou regurgitantes, são freqüentemente adicionados para replicar a contribuição de hamps9,10,11. A criação de um tamanho específico e tipo de ferida e a aplicação de quantidades precisas de HAMPs é uma vantagem para estes tipos de estudos e pode oferecer resultados mais reprodutíveis. Estudos herbívoros naturais, onde o dano ao tecido vegetal é realizado pela aplicação de insetos adquiridos em campo ou de laboratório, são muitas vezes mais desafiadores porque as quantidades de tamanho da ferida e do HAMP são governadas pelo comportamento de insetos e adicionam variabilidade ao Dados. Os métodos naturais versus simulados e suas vantagens e desvantagens são bem debatidos na literatura12,13,14.

Para estudar eventos de sinalização precoce, como fatores de transcrição, uma determinada porcentagem da folha deve ser consumida em um período de tempo relativamente curto, de modo que as larvas devem começar a mastigar imediatamente e manter o consumo até que a folha seja congelada para análise. M. sexta é um alimentador voraz em várias plantas solanáceas durante muitos de seus estágios larval, fazendo o ideal para transmitir dano máximo em uma quantidade relativamente curta de tempo15. Isso é conveniente ao estudar eventos de sinalização precoce, pois a resposta da planta ocorre quase que imediatamente após um inseto contata a superfície foliar16,17. O método comumente usado da gaiola do grampo da contenção prova desajeitado, porque as gaiolas múltiplas exigiriam ajustes contínuos durante todo a experimentação para permitir a remoção ou a adição de larvas. As folhas devem igualmente ser grandes bastante e forte bastante suportar os insetos múltiplos que alimentam ao mesmo tempo. Estes tipos de plantas de batata exigem uma grande quantidade de espaço para observar a alimentação. As larvas frequentemente se realocarão para a parte inferior da superfície foliar, o que também torna as observações de alimentação bastante difíceis. Usar plantas inteiras para executar estes experimentos é claramente complicado.

O estudo atual usa folhas destacadas isoladas em placas de Petri um pouco do que plantas inteiras para simplificar e simplificar a aproximação inteira da planta a estudar o herbivory. A aplicação do protocolo neste estudo limita-se à observação de um grupo de C2H2 fatores de transcrição induzidos precocemente em folhas de batata após lesão herbívora por larvas de M. sexta .

Protocol

Observação: o protocolo a seguir foi projetado para uma pessoa configurar, fazer observações e coletar amostras. Várias execuções da mesma configuração podem ser combinadas para aumentar a replicação biológica. Quaisquer repetições adicionais do experimento devem ser configuradas ao mesmo tempo do dia para eliminar possíveis influências diurnas na expressão gênica. O protocolo é projetado para criar 3 folhas ‘ infestadas ‘ para 5 pontos de tempo de colheita separados. As folhas de controle corresponden…

Representative Results

O consumo foliar define o sucesso do protocolo. As larvas saudáveis, encenadas exatamente devem começar a alimentar imediatamente depois que a colocação na superfície da folha e a alimentação devem continuar em uma maneira razoavelmente consistente durante todo o tempo da infestação. No vídeo 1, a larva no topo começa a mastigar imediatamente após a colocação e mantém uma taxa consistente durante a alimentação. Isto é especialmente importante se ensaio e…

Discussion

O uso de metodologias herbívórias de plantas inteiras existentes é desnecessário para atingir o objetivo deste estudo em particular (ou seja, um conjunto de genes candidatos para sua resposta à infestação). O benefício óbvio do refinamento desanexado da folha é encurtar o tempo que toma para executar ensaios herbivoria. A natureza pesado de plantas inteiras com gaiolas do grampo é eliminada e os ensaios são executados mais logo, desde que as plantas tão novas quanto 2 semanas podem ser usadas para colher fol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Bob Farrar e Alexis Park por fornecer insetos usados neste estudo e por sua expertise em estadiamento larval. Agradecimentos adicionais a Michael Blackburn e Saikat Ghosh para a revisão crítica do manuscrito.

Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é unicamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura dos EUA.

USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador.

Materials

agar substitute PhytoTechnology Laboratories G3251 product is Gelzan
containment vessel (6,12 or 24 well dish) Fisher Scientific  08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 many other companies sell these products
manduca eggs  Carolina Biological Supply Company 143880 30-50 eggs
manduca eggs  Great Lakes Hornworm NA 50, 100, 250 or 500 eggs
manduca larvae Carolina Biological Supply Company call for specific larval instar requests any instar
manduca larvae Great Lakes Hornworm call for specific larval instar requests any instar
microcentrifuge tubes, 1.7 ml  Thomas Scientific 1158R22 these have been tested in liquid N2 and will not explode
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins PhytoTechnology Laboratories M519 used to make propagation medium
nutrient agar mix PhytoTechnology Laboratories M5825 product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan
paper filter discs Fisher Scientific  09-805A Whatman circles-purchase to fit in petri dish
petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm Fisher Scientific  FB0875713A or FB0875712 purchase size appropriate for leaf size
potato tubers  any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
pots, 10"  Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 41PT1000CN2
preservative/biocide Plant Cell Technology NA product is PPM (Plant Preservative Mixture)
seed potatoes for explant source any B size (not organic) suggest Maine Farmer’s Exchange
slow release fertilizer (14-14-14 ) any NA Osmocote is a popular brand name
soft touch forceps BioQuip 4750
soil mix Griffin Greenhouse Supplies, Inc. 65-51121 product is Sunshine LC1 mix
sterile culture vessel  PhytoTechnology Laboratories C2100 Magenta-type vessel, PTL-100
sterile culture vessel  Fisher Scientific  ICN2672206 product is MP Biomedicals Plantcon

References

  1. Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
  2. Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
  3. Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
  4. Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
  5. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
  6. Chen, M. -. S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
  7. Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
  8. War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
  9. McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
  10. Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
  11. Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
  12. Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
  13. Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
  14. Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
  15. Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
  16. Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
  17. Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
  18. Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
  19. Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
  20. Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
  21. Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
  22. Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
  23. Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
  24. Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R., Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
  25. Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
  26. Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
  27. Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
  28. Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
  29. Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
  30. Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
  31. Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
  32. Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
  33. Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
  34. Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
  35. Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
  36. Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
  37. Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
  38. . Hornworms Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018)
  39. . Products Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018)
  40. . Raising Manduca sexta Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018)
  41. . Teach life cycles with the tobacco hornworm Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018)
  42. Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).

Play Video

Cite This Article
Novak, N. G., Perez, F. G., Jones, R. W., Lawrence, S. D. Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta. J. Vis. Exp. (147), e59153, doi:10.3791/59153 (2019).

View Video