Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.
Dolaşımdaki ve interstisyel küçük membran bağlı hücre dışı veziküller (EVs) roman tanılama ya da prognostik biyomarker deneyleri geliştirilmesi için umut verici hedefleri temsil ve büyük olasılıkla a geniş tayf-in ilerleme önemli oyuncular olarak hizmet hastalıklar. EVs rolünü ateş, inflamasyon ve kanser gibi koşullardan patogenezinde daha iyi doku türlerini anlamak ve mevcut araştırma birden çok hücreden salgılanan veziküller karakterizasyonu üzerine odaklanmıştır. Ancak, genel olarak tutarlı ve tekrarlanabilir teknikleri yalıtmak ve veziküller arındırmak için devam eden kalır. Ayrıca, sağlam doku ex vivo EVs, çıkarılması için yöntem pek açıklanmıştır. Burada, biz daha fazla karakterizasyonu için beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere bütün taze veya dondurulmuş dokular, ilgi küçük EVs çıkarma için detaylı bir protokol sağlar. Elektron mikroskobu ve veziküller immunophenotypic karakterizasyonu, hem de nicel kütle spektrometresi EV proteinlerin de dahil olmak üzere birden çok aşağı akım analizleri için bu yöntemin uyum göstermektedir.
Küçük hücre dışı veziküller (EVs) endosomal elde edilen exosomes ve geniş Biyomedikal ilgi vardır küçük membran-döken microvesicles içerir. Küçük EVs 50-250 nm membran bağlı veziküller biyolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve topluca hastalığı işlemleri çok sayıda önemli rol oynarlar inanılıyor nükleik asitler içeren türdeş olmayan nüfusu oluşur. Araştırma ilerleyen özellikle bu veziküller nörodejeneratif ve prion hastalıkları, bulaşıcı süreçleri, otoimmün veya enflamatuar ve tümör büyümesini ve metastaz1,2,3 karıştığı , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Biyomedikal araştırma EVs önemini hastalık patogenezinde içine hızla yalıtım ve bu veziküller arınma için tekrarlanabilir ve titiz yöntemleri gelişmekte olan paralel faiz oluşturulan.
EV karakterizasyonu tarihsel ve güncel mücadelesine küçük EV altgrupları tamamen ayırmak için yetersizlik olmuştur. Bu büyük ölçüde farklı veziküller Biyogenez yöneten farklı moleküler mekanizmaları bizim sınırlı anlayış nedeniyle mücadeledir. Boyutu, yoğunluk ve biyolojik kargo daha fazla altgrupları arasında örtüşen bu farklılıklar convolutes. Bu sınama bir parçası da yaygın olarak zenginleştirme teknikleri farklı laboratuvarlar arasında tutarsızlık izole veziküller aşağı akım analizi sağlayan ve kategorik EV nüfus aydınlatmak için küresel çaba zayıflatmayı kullanımı olmuştur.
Bu EV karakterizasyonu çoğunluğu veziküller hayvan veya insan vücut sıvıları, plazma, idrar da dahil olmak üzere gelen yalıtmak için teknikleri açıklayan daha yeni içinde vivo çalışmalar ile hücre kültürü süpernatant, tüp bebek koleksiyonundan gerçekleştirildikten dikkati çekiyor ve tükürük. EVs büyük miktarlarda dolaşımda iken, aynı zamanda bu veziküller hücre hücre iletişim olaylarda önemli rol oynarlar ve hücresel doku interstitium içinde bulunan tanıdı. Kanser bağlamında, interstisyel EVs tümör microenvironment tohum kanser hücresi ve metastatik büyüme14,15için modüle özellikle önemli olabilir. Sonuç olarak, geliştirme ve optimizasyon teknikleri veziküller sağlam doku örnekleri ayıklamak için değeri vardır. Bu yöntemleri doğrudan organ – okumak için bir yol sağlar veya tümör küçük biyopsi ve kısmi veya tam organ rezeksiyonu da dahil olmak üzere Klinik numune–dan hasat EVs türetilmiş.
Bu çalışmada ve bizim laboratuvar16tarafından yayımlanan bir önceki rapor, biz birkaç önemli Şu anki endişelerini EV zenginleştirme yöntembilim amacı: 1) yalıtmak ve şu anda en yüksek standartlarda EVs arındırmak için bir tekrarlanabilir tekniğini tanımlamak için alanını kabul; 2) son derece endosomal elde edilen exosomes zenginleştirilmiş küçük EV altgrupları yalıtmak girişimi için; ve 3) bir iletişim kuralı üzerinden sağlam doku örnekleri daha fazla karakterizasyonu amacıyla bu veziküller çıkarma için sağlamak için.
Son zamanlarda, Kowal ve meslektaşları ayırmak ve EV altgrupları karşılaştırılabilir sükroz yoğunluk gradyanlar17daha büyük etkinlik ile arındırmak için nispeten küçük ölçekli iodixanol yoğunluğu degrade nitelendirdi. Atıf çalışmada, dendritik hücre kaynaklı EVs esir nispeten hafif yoğunluk kesir, 1.1 g/mL, bir yoğunluk ile tutarlı olarak son derece exosomes bu mevcut yüksek bir oran ile en tutarlı olduğuna inanılan endosomal proteinler zenginleştirilmiş kesir. Yazarlara göre bu “iyi niyetli” exosomal proteinler tümör duyarlılık gen 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 ve birkaç annexin proteinler17dahil. Daha sonra doku ayrılma Perez-Gonzalez ve ark18 ve bütün beyin kaynaklı EVs16izole etmek için bir sonraki fark Santrifüjü protokol tarafından açıklanan yöntemin başarılı olması için bu tekniği uyarlanmış. Biz de bu yöntemin aşağı akım nicel ve karşılaştırmalı kütle spektrometresi veziküler protein, daha önce bizim laboratuvar19tarafından açıklanan için sıralı bir protokol birleştirerek EV proteomes karakterize içinde gösterdi. Bu eser bu hangi beyin20frontal korteks EVs zenginleştirilmiş Hill laboratuvarından paralellik.
Bu çalışmada bu tekniği ayrıntılı ve son zamanlarda EVs izolasyonu sağlam akciğer tümörleri için bizim laboratuardan yayınlanan Protokolü uygulamayı genişletebilir. Bilgimizi, bu EVs üzerinden ex vivo tümör numuneler zenginleştirmek için iletişim kuralı tanımlamak için ilk çalışmadır. Yeni tanı Biyomarkörler ve tumorigenesis içindeki rollerine EVs yaygın ilgi göz önüne alındığında, bu yöntem büyük olasılıkla bilimsel araştırmacılar, giderek artan sayıda için değerli olacağını. Klinik bir bakış açısından, interstisyel EVs büyük tanı değeri, özellikle numuneler histolojik değerlendirme sınırlı nerede liman. Burada özetlenen Yöntem hastalığın patogenezinde önemli roller bunlar küçük ortaya çıkarmak yapılacak çalışmalar için önünü taze veya dondurulmuş hayvan veya insan cerrahi numuneler, üzerinden EVs hasat tekrarlanabilir bir tekniği için bir temel sağlayacaktır bizim umudumuz veziküller oynayabilir.
Çok bilimsel ilgi küçük EVs tümör microenvironment yanı sıra organ gelişimi, olgunlaşma ve işlev oynamak rolleri açısından oluşturuldu. Genel olarak, bu çalışmada olduğu gibi EVs çekme–dan tüm beyin veya tümör numuneler için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışı sağlar. Burada biz sadece tümör kaynaklı akciğer EVs bu tekniğe uygulanabilirliği göstermek iken, bu yöntem kolayca daha fazla ex vivo karakterizasyonu olan küçük salgılanan veziküller dinleyicilere diğer sağlam dokul…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Dr Richard Nowakowski ve sağlayan ve bu iletişim kuralı, saygıyla geliştirmek için kullanılan hayvanlar için bakım için Florida Devlet Üniversitesi laboratuvar hayvan kaynakları teşekkür ederiz. Biz aşağı akım vezikül karakterizasyonu yanı sıra FSU biyolojik bilim görüntüleme kaynak tesis için kullanılan kütle spektrometresi çalışma ile Xia Liu, Dr Rakesh Singh ve Florida Devlet Üniversitesi translasyonel bilim laboratuvarı yardım için teşekkür Transmisyon Elektron mikroskobu bu çalışmanın kullanımı. Son olarak, Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M Üniversitesi) Bu yöntem geliştirmede kullanılan tümör örneklerin bağış için teşekkürler. Bu çalışmada Florida Bölümü Sağlık Ed ve Ethel Moore Alzheimer hastalığı araştırma D.G.M. ve J.M.O (6AZ11) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası altında Ulusal Kanser Enstitüsü için ödül programı gelen hibe tarafından desteklenmiştir D.G.M. için verilen R01CA204621
0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
NanoSight LM10 | Malvern | ||
Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |