全体組織からの細胞の小胞の抽出
Summary
ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs を抽出する再現性のある手法を提供しています。
Abstract
循環と格子間原子小さな膜結合型細胞小胞 (Ev) 新規診断や予後バイオ マーカーのアッセイの開発のための有望なターゲットを表し、可能性の広大なスペクトルの進行での重要なプレーヤーとして病気。現在の研究は複数の細胞から分泌される小胞のキャラクタリゼーションに焦点を当ててより良い組織の種類は神経変性、炎症、癌などの条件の病因に EVs の役割を理解します。しかし、グローバルに一貫した、再現性のあるテクニックを分離し、小胞を浄化は進行中のまま。また前のヴィヴォ固体ティッシュから EVs の抽出方法、やっとのことで説明します。ここでは、さらに特性評価のための脳、腫瘍標本を含む全体の新鮮なまたは冷凍の組織から関心の小型 Ev を抽出するための詳しいプロトコルを提供します。この電子顕微鏡および小胞の肺浸潤特性だけでなく、EV 蛋白質の量的な質量を含む複数のダウン ストリーム解析法の適応性を示します。
Introduction
小さな細胞小胞 (Ev) は、エンドソーム派生エクソソームと広範な生物医学的関心のある小さな膜小屋ミクロベシクルに含まれます。小型 Ev は、生物活性タンパク、脂質、および病気プロセスの多数の重要な役割を果たすと考えられている総称して核酸を含む 50 250 nm 膜結合型ベシクルの異種集団で構成されます。神経変性疾患とプリオン疾患、感染プロセス、自己免疫・炎症性条件と腫瘍の増殖や転移1,2,3にこれらの小胞を特に関与して研究を進めています。,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。 分離そしてこれらの小胞の浄化のための再現性・厳格な方法の開発に平行関心を生成している病因における EVs の意義に急速な生物医学研究。
EV の特性の歴史と現在の挑戦は、小型 EV のサブポピュレーションを完全に分離することができないことをされています。この課題は、異なる小胞の形成を支配する異なる分子メカニズムの私達の限られた理解の主因です。これらの区別を convolutes サイズ、密度、およびさらに集団間の生物学的製剤の貨物を重複します。このような課題の一部には広く濃縮技術を異なる所で隔離された小胞の下流における矛盾を提供する、カテゴリの EV 集団を照らすに世界的な努力を損なう使用もされました。
それは動物や人間の体液、血漿、尿を含む小胞を分離する技術を記述する生体内での最近の研究と in vitro における細胞培養上清、集から EV の特性の大半が実行されていることは注目に値する、と唾。一方、EVs が流通に大量に存在するこれらの小胞が細胞間コミュニケーション イベントで重要な役割を果たして、細胞組織の間質に存在をも認識します。癌の中では、間質性の EVs が癌細胞播種、転移性成長14,15がん微小環境を調節する際に特に重要な可能性があります。したがって、開発と最適化の固体組織標本から小胞を抽出する手法で価値があります。これらのメソッドは、直接研究器官に手段を提供するまたは腫瘍由来の EVs 小さな生検と部分的または完全臓器切除を含む、臨床検体から収穫されます。
この研究と当社研究所16刊以前のレポートでは、EV 濃縮方法論のいくつかの主要な現在の懸念に対処を目指して: 1) を分離し、現在最高の基準に EVs を浄化する再現性のある手法について説明するにはフィールドで受け入れ2) 小型 EV subpopulations エンドソーム派生エクソソーム; 高濃縮を分離しようとする・ 3) さらに評価の目的のための固体組織標本からこれらの小胞の抽出のためのプロトコルを提供します。
最近、Kowal と同僚は、分離し、匹敵するショ糖密度勾配17より大きい有効性によって EV subpopulations を浄化する比較的小規模な iodixanol の密度勾配を説明します。引用における密度 1.1 g/mL、一貫性のある比較的軽い密度分数でキャプチャされた樹状細胞由来 EVs 高エクソソームこの存在の割合が高いと最も一致する信じられるエンドソーム蛋白質で濃縮しました。割合です。作者によれば、これら「善意」exosomal 蛋白質はいくつかアネキシン タンパク質17、EHD4、ADAM10 CD81 腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) syntenin 1 を含まれています。我々 はその後ペレス ・ ゴンザレスら18と全く脳由来 EVs16を分離する続く差動遠心分離のプロトコルで記述された組織解離法を成功するためにこの手法を適応しました。また、下流定量的および比較私たちの研究所の19に記載された小胞タンパク質の質量分析のための連続したプロトコルを組み合わせることによって EV プロテオームの特性でこのメソッドの有用性を示した。この仕事20脳の前頭葉から EVs が豊かな丘の研究室からあった。
本研究では、この手法に手の込んだ、EVs の固体腫瘍から分離に当研究室から最近公開されたプロトコルのアプリケーションを拡張します。私たちの知る限り、これは生体内の腫瘍の標本 ex から EVs を豊かにするためのプロトコルを記述する最初の研究です。このメソッドは、新規の診断バイオ マーカーとその腫瘍形成における役割として EVs で広範な関心を与え、科学研究者の数が増えている貴重なを可能性が高い証明します。臨床的観点から間質性 EVs は組織学的評価は限られた標本を中心に、素晴らしい診断的価値を抱くことが。私たちの希望は、ここで概説している方法は再現手法が新鮮なまたは冷凍動物または人間手術標本から、明らかに病気の発症に重要な役割これら小さな将来の仕事のための道を舗装 EVs を収穫するための基盤を提供小胞を再生可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
小型 Ev における器官形成、成熟と機能だけでなく、腫瘍微小環境におけるの役割に関して多くの科学的関心が生成されました。全体的にみて、この研究では、脳全体または腫瘍の標本からそのまま EVs の抽出最適化されたワークフローを提供します。このメソッドが簡単に適応のある小さな分泌小胞の ex vivo 評価さらに機会を提供する他の固体組織の仕事のためかもしれないここで肺腫瘍由?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、博士リチャード ・ スキーと提供し、丁重にこのプロトコルを開発するために使用する動物を気遣うフロリダ州大学研究室動物資源をありがとうございます。我々 は下流の小胞のキャラクタリゼーションと FSU 生物科学イメージング資源施設に使用される質量分析作業と夏 liu さん、博士 Rakesh シンと、フロリダ州立大学並進科学研究所支援のために感謝します。本研究では、透過型電子顕微鏡の使用。最後に、博士 Mandip Sachdeva (フロリダ A & M 大学) は、このメソッドの開発で使用される腫瘍の標本の寄付を感謝いたします。本研究は、授与賞数の下で健康の国民の協会の国立癌研究所と J.M.O (6AZ11) D.G.M. Ed 健康のフロリダ部とエセル ・ ムーア アルツハイマー病研究プログラムからの助成金によって支えられました。R01CA204621 D.G.M. に授与
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
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