전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출
Summary
여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.
Abstract
순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.
Introduction
작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 빠르게 성장 하는 생물 의학 연구 질병 병 인에서 EVs의 중요성으로 재현 하 고 엄격한 격리와 이러한 vesicles의 정화에 대 한 방법을 개발에 병렬 관심을 생성 했다.
EV 특성에서 역사적이 고 현재 도전 못하는 작은 EV 모집단을 완전히 분리 되었습니다. 이 문제는 주로 통치 별개 소포 속 다른 분자 메커니즘의 우리의 제한 된 이해 예정 이다. 크기, 밀도, 그리고 생물 학적 화물 더 부분 모집단 사이 오버랩이 구분 convolutes. 이 과제의 일부 또한 널리 다른 농축 기술, 실험실, 걸쳐 격리 vesicles의 다운스트림 분석에 불일치를 제공 하 고 범주별 EV 인구를 밝히는 글로벌 노력을 훼손 사용 되었습니다.
그것은 대부분 EV 특성화의 플라스마, 소변을 포함 한 동물이 나 인간의 체액에서 소포를 분리 하는 기법을 설명 하는 더 최근의 vivo에서 연구 표면에 뜨는, 세포 배양의 생체 외에서 컬렉션에서 수행 되었습니다 협조할 그리고 타 액. EVs는 순환에 대량에서 존재, 그것은 또한 이러한 vesicles 셀 통신 이벤트에서 중요 한 역할을 하 고 세포 조직의 interstitium에 인식. 암의 맥락에서 중간 EVs는 특히 암 세포 시드 및 전이성 성장14,15종양 microenvironment 변조에 중요 한 있을 수 있습니다. 따라서, 개발 및 단단한 조직 표본에서 소포를 추출 하는 기술의 최적화 값이입니다. 이러한 방법은 직접 연구 기관-수단을 제공할 것입니다 또는 종양에서 파생 된 EVs 작은 biopsies을 부분 또는 전체 기관 절제술을 포함 하 여 임상 표본에서 수확.
이 연구와 우리의 실험실16출판 이전 보고서 우리는 EV 농축 방법론에서 여러 주요 현재 문제를 해결 하고자: 1) 격리 하 고 현재 수준에 EVs를 정화 재현 기술을 설명 하 필드 확인 허용 작은 EV 모집단 endosomal에서 파생 된 exosomes;에 고도로 농축을 시도 2) 그리고 3) 더 특성을 위해 단단한 조직 표본에서 이러한 vesicles의 추출에 대 한 프로토콜을 제공 하.
최근, Kowal 및 동료 상대적으로 소규모 iodixanol 밀도 그라디언트 분리 및 정화 EV 모집단 비교 자당 밀도 기울기17보다 큰 효능을 설명 합니다. 매우 인용된 연구 수지상 세포 유래 EVs에 상대적으로 가벼운 밀도 분수, 1.1 g/mL의 조밀도와 일치 했다 endosomal 단백질이에 exosomes의 높은 비율로 가장 일관 된 것으로 농축 분수입니다. 저자에 따르면이 “진실한” exosomal 단백질 종양 민감성 유전자 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4, 그리고 여러 annexin 단백질17포함. 우리는 나중에 성공 조직 분리 페레즈 곤잘레스 외18 및 전체 두뇌 파생 EVs16을 후속 차등 원심 분리 프로토콜에서 설명 하는 방법에이 기술을 적응. 우리는 또한 우리의 실험실19설명한 기공을 단백질의 다운스트림 양적 및 비교 질량 분석에 대 한 순차적 프로토콜을 결합 하 여 EV proteomes 특성화에이 방법의 유틸리티를 설명 했다. 이 작품은 EVs 두뇌20담당에서 농축 된 힐 연구소에서 그을 평행 시켰다.
이 연구에서 우리이 기술에 대해 자세히 설명 하 고 최근 우리의 실험실에서 고체 폐 종양에서 EVs의 격리에 게시 하는 프로토콜의 응용 프로그램을 확장. 우리의 지식을 하려면이 ex vivo 종양 표본에서 EVs를 풍부 하 게 하는 프로토콜을 설명 하기 위해 첫 번째 연구 이다. 새로운 진단 바이오 마커 및 tumorigenesis에서 그들의 역할 EVs에 광범위 한 관심을 감안할 때,이 방법은 가능성이 증명 과학 연구원의 성장 수에 중요 한. 임상의 관점에서 중간 EVs 더 평가 제한 됩니다 표본에서 특히 훌륭한 진단 가치를 항구 수 있습니다. 우리의 희망은 여기에 설명 된 방법 신선 또는 냉동 동물 또는 인간 수술 표본, 밝히기 위해서 질병 병 인에 중요 한 역할이 작은 미래의 일에 대 한 방법을 포장에서 EVs를 수확 하는 재현 기법에 대 한 기초를 제공할 것입니다. 소포를 재생할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 박사 리처드 Nowakowski와 플로리다 주립 대학 실험실 동물의 리소스를 제공 하 고 정중 하 게이 프로토콜을 개발 하는 데 사용 하는 동물에 대 한 배려 감사 합니다. 우리는 다운스트림 소포 특성 뿐만 아니라 FSU 생물 과학 이미징 리소스 시설 사용 질량 분석 작업과 쌰 Liu, 박사 Rakesh 싱, 그리고 지원에 대 한 플로리다 주립 대학 변환 과학 연구소 감사 이 연구에서 전송 전자 현미경의 사용. 마지막으로, 우리는이 방법의 개발에 사용 되는 종양 견본의 기부에 대 한 박사 Mandip Sachdeva (플로리다 A & M 대학) 감사 합니다. 이 연구는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 무어 Alzheimer의 질병 연구 프로그램에서 D.G.M. 및 J.M.O (6AZ11)와 보너스 번호 아래 국립 보건원의 국립 암 연구소 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 R01CA204621 D.G.M.에 게 수 여
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
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