Summary

Alveoler makrofaj fagositoz ve bakteri izni farelerde

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Burada fare alveoler makrofajlar ve akciğer üzerinden bakteriyel Temizleme fagositik işlevi analiz etmek için ortak yöntemleri raporu. Bu yöntemler floresein isothiocyanate boncuk tüp bebek fagositoz ve Pseudomonas aeruginosa yeşil flüoresan protein içinde vivo fagositoz çalışma. Biz de P. aeruginosa farelerde temizlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer alveoler alan koru. Fagositoz AMs tarafından istila karşı patojenler, ölü hücreleri veya yabancı parçacıklar kaldırılmasını savunmak için kritik bir rol oynamaktadır ve inflamatuar yanıt ve doku remodeling çözünürlüğünde, işler bu tarafından çeşitli yüzey reseptörlerinin aracılı AMs. Burada, desen tanıma reseptör-, Kompleman reseptör- ve Fc gama reseptör aracılı arasında ayırt etmek için tüp bebek ve içinde vivo deneyleri ve deneysel stratejiler kullanarak AMs fagositik fonksiyonu analizi için yöntemler raporu fagositoz. Son olarak, biz bir yöntem oluşturmak ve P. aeruginosa pnömoni manken bakteriyel yetkisi içinde vivo değerlendirmek farelerde karakterize tartışıyorlar. Bu deneyleri AM işlevleri değerlendirmek için en yaygın yöntemleri temsil ve makrofaj işlevi ve diğer organlarda bakteriyel Temizleme çalışması için de kullanılabilir.

Introduction

AMs büyük ikamet fagositler alveoller içinde dinlenme sahne ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanıma yoluyla büyük oyuncular ve inhale patojenler ve yabancı parçacıklar1,2içselleştirilmesi vardır. Bu yüzden AM fagositoz bir eksikliği genellikle solunum içinde sonuçları AMs P. aeruginosa ve Klebsiella zatürre3,4gibi birçok akciğer patojenlerin hızlı geçiş izni için gerekli olan bildirilmiştir yüksek mortalite ve morbidite oranları neden enfeksiyonlar, akut pnömoni gibi.

AMs Ayrıca akciğer doğuştan gelen inflamatuar yanıt sitokinler ve TNF-α ve IL-1β, hangi crosstalk kemokinler üretmek ve inflamatuar nötrofil, monosit, askere alveoler çevrenin diğer hücrelerle gibi kemokinler üreterek başlatmak ve edinilmiş bağışıklık hücreleri akciğer5. Örneğin, IL-1β AMs tarafından üretilen nötrofil Kemokin CXCL8 yayın epitel hücreleri6hazırlamak için yardımcı olur. Ayrıca, hücre içi enzimler sürekli kaçağı neden PMNs gelen başarısızlık çevreleyen doku, doku hasarı sonucu ve uzun süreli iltihap fagositoz apoptotik polimorfonükleer lökositlerin (PMNs), AMs katkıda 7 , 8 , 9.

AMs tarafından fagositoz yanında kalıplarının patojen ilişkili moleküler patojen yüzeyi AMs desen tanıma reseptörleri (PRRs) veya opsonized patojenler bağlama AMs bağışıklık efektör reseptörleri ile doğrudan bir Tanıma aracılık ettiği 10. için ikinci, AMs immünglobulin (IgG) ile opsonized hedefleri onların Fcγ reseptörleri (FcγR) algılayabilir veya patojenler (CR)11tamamlayıcı parçaları, C3b ve C3bi, onların tamamlayıcı reseptörleri ile kaplanmış. Kompleman reseptörü arasında immünglobulin süper (CRIg) CR doku makrofajlar12‘ seçmeli olarak ifade edilir ve son bulma AM fagositoz bağlamında P. aeruginosa pnömoni, CRIg rolü vurgulanacak 13.

Birçok özgün çalışma yöntemleri makrofaj işlevi14,15moleküler mekanizmaları açıklamak için makrofaj fagositoz değerlendirmek için kullanın. Ancak, içinde vivo fagositoz gibi yöntemler fagositoz kesin bir miktar gerektirir. Burada, tüp bebek ve içinde vivo fagositoz floresein isothiocyanate (FITC) kullanarak için detaylı bir metodoloji özetlemek-cam boncuk ve P. aeruginosa yeşil flüoresan protein (GFP), anılan sıraya göre. Ayrıca, biz PRR, CR ve FcγR-aracılı fagositoz arasında differentiating yöntemi açıklar. Son olarak, bakteriyel temizleme Mouse P. aeruginosa pnömoni ile ilgili olarak niteleyen bir yöntemi bildirin.

Protocol

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Doğu Virginia Tıp Fakültesi kuralları izler. 1. floresan boncuk fagositoz Fare ötenazi (C57BL/6J, 6 hafta yaşlı, kadın) hayvanların IACUC iletişim kuralları etik ötenazi için göre CO2 boğulma tarafından. Kağıt havlu ile kaplı bir diseksiyon tahta üzerinde fareyi atmasından yatıyordu. Onun pençeleri ile onun bacaklarda spread-eagle pin ve böylece geri nefes borusunu …

Representative Results

Fagositoz fare tarafından analiz için deney yapılan ilk birincil AMs. Tüm analizleri AMs WT ve TRIM72KO fareler izole karşılaştırıldığında. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi Floresans mikroskobu o fagositoz FITC-cam boncuk birincil AMs oluşur kuluçka 1 h sonra fare tarafından saptandı. Resim 1 B Akış Sitometresi tarafından fagositoz analizini gösterir. Mikroskopi …

Discussion

Gaz değişimi işlevi yerine getirirken, akciğer ısrarla yabancı parçacıklar, patojenler ve alerjenleri yüzleşir. AMs onların ana işlevi, yani fagositoz gereğince savunma ilk satırı sağlar. AMs da diğer bağışıklık hücreleri patojenleri yok ve inflamasyon çözünürlük ile koordine. Burada, biz yöntemleri özellikle fare akciğer izole AMs tarafından fagositoz değerlendirmek için nitelendirdi. Bu el yazması sunulan Protokolü makrofaj işlevi ve diğer organlarında bakteri izni çalışmaya da…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser grant R01HL116826 için X. Zhao tarafından desteklenmektedir.

Materials

18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

References

  1. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
  2. Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
  3. Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
  4. Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
  5. Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
  6. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
  7. Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
  8. Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
  9. Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
  10. Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
  11. Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  12. He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
  13. Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
  14. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  15. Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
  16. Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
  17. Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).

Play Video

Cite This Article
Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

View Video