מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים
Summary
כאן אנחנו מדווחים על שיטות נפוצות כדי לנתח את הפונקציה phagocytic של מקרופאגים מכתשי מאתר ואישור חיידקים מן הריאות. שיטות אלה לומדים phagocytosis במבחנה של חרוזים isothiocyanate fluorescein ו- phagocytosis ויוו של Pseudomonas aeruginosa חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנו גם מתארים שיטה לניקוי aeruginosa פ בעכברים.
Abstract
עיצור מכתשי, מקרופאגים (AMs) השומרים את החלל מכתשי של הריאה. Phagocytosis מאת AMs משחק תפקיד קריטי בהגנה נגד הפולשים פתוגנים, הסרת תאים מתים או חלקיקים זרים, ומעבד בהחלטה תגובות דלקתיות ושחזור רקמות, מתווכת על ידי רצפטורים משטח שונים של AMs. כאן, אנחנו מדווחים שיטות לניתוח של הפונקציה phagocytic של AMs באמצעות מבחני במבחנה, ויוו ואסטרטגיות ניסיוני כדי להבדיל בין דפוס זיהוי הקולטן-, המשלים קולטן-Fc גמא קולטן בתיווך phagocytosis. לבסוף, נדון שיטה ליצירה ולקביעת לאפיין את מודל דלקת ריאות aeruginosa פ בעכברים כדי להעריך ויוו חיידקי סיווג. מבחני אלה מייצגים את השיטות הנפוצות להערכת AM פונקציות, יכול לשמש גם ללמוד מקרופאג פונקציה ו סיווג חיידקי באיברים אחרים.
Introduction
AMs הינם phagocytes תושב הגדולות ב alveoli השלב מנוחתו, אחד השחקנים הראשיים של תגובות מערכת החיסון המולדת דרך ההכרה, הפנמה של פתוגנים בשאיפה וחלקיקים זרים1,2. בעבר דווח כי AMs הם חיוניים עבור פינוי מהיר של פתוגנים ריאתי רבים כגון aeruginosa פ ודלקת ריאות קלבסיאלה3,4, אז חוסר AM phagocytosis לעתים קרובות התוצאות הנשימה זיהומים, כגון דלקת ריאות חריפה, הגורמים שיעור גבוה של תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית.
AMs גם ליזום תגובות דלקתיות מולדת בריאה על ידי ייצור ציטוקינים ו נוגדנים כגון TNF-α ו- IL-1β, אשר crosstalk עם תאים אחרים של הסביבה מכתשי לייצר נוגדנים, לגייס נויטרופילים דלקתיות, ומונוציטים, ו תאים חיסוניים מסתגלת ב- ריאות5. לדוגמה, IL-1β המיוצר על ידי AMs מסייעת פריים לשחרור נויטרופילים כימוקין CXCL8 לתאי האפיתל6. יתר על כן, AMs לתרום phagocytosis אפופטוטיים להיפגע אורך חייהם יצירת לויקוציטים (PMNs), כשל של כשבסופו לדליפת מתמשכת של אנזימים תאיים מ PMNs הרקמה שמסביב, והתוצאה היא נזק לרקמות, דלקת ממושכת 7 , 8 , 9.
Phagocytosis מאת AMs מתווך על ידי הכרה ישירה של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית על פני השטח הפתוגן קולטני זיהוי דפוס (PRRs) של AMs או על ידי האיגוד של פתוגנים opsonized עם אפקטור החיסון רצפטורים של AMs 10. עבור האחרון, AMs יכול לזהות את המטרות opsonized עם אימונוגלובולינים (IgG) דרך רצפטורים Fcγ שלהם (FcγR) או פתוגנים מצופה המשלים שברים, C3b, C3bi, דרך רצפטורים המשלים שלהם (CR)11. בין רצפטורים המשלים, הכי טובים ביותר של superfamily אימונוגלובולינים (CRIg) מתבטאת באופן סלקטיבי רקמות מקרופאגים12, והדגשתי ממצא האחרונות בתפקיד CRIg ב AM phagocytosis בהקשר של דלקת ריאות aeruginosa פ 13.
מחקרים מקוריים רבים להשתמש בשיטות להעריך מקרופאג phagocytosis כדי לתאר את המנגנונים המולקולריים של מקרופאג פונקציה14,15. עם זאת, שיטות כמו phagocytosis ויוו לדרוש כימות מדויק של phagocytosis. כאן, אנו מסכמים מתודולוגיה מפורט phagocytosis ויוו והן במבחנה באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-זכוכית חרוזים, חלבון פלואורסצנטי aeruginosa פ ירוק (GFP), בהתאמה. עוד, נסביר את שיטת המבדילים בין PRR – CR-, בתיווך FcγR phagocytosis. בסופו של דבר, אנחנו מדווחים על שיטה לאפיון סיווג חיידקי עכבר ביחס פ aeruginosa דלקת ריאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תוך כדי ביצוע פונקציה חילופי גז, הריאה בהתמדה מתעמת עם חלקיקים זרים, פתוגנים, אלרגנים. AMs לספק את השורה הראשונה של הגנה מכוח תפקידם העיקרי, כלומר phagocytosis. AMs גם לתאם עם תאים חיסוניים אחרים להרוס פתוגנים, הרזולוציה של דלקת. כאן, אנחנו תיאר שיטות להערכת במיוחד phagocytosis מאת AMs מבודד מן הריאות העכבר. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך על ידי מענק R01HL116826 X. Zhao.
Materials
| 18-G Needle | Nipro Medical | CI+1832-2C | Molecular Biology grade |
| 2,7-diaminofluorene (DAF) | Sigma-Aldrich | D17106 | Molecular Biology grade |
| 70% Ethanol | Decon Labs Inc. | 18C27B | Analytical grade |
| 96-well plate | Corning | 3603 | Cell Biology grade |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492 | Molecular Biology grade |
| Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle | Thermofisher Scientific | Z23373 | Molecular Biology grade |
| C5 deficient serum | Sigma-Aldrich | C1163 | Biochemical reagent |
| Centrifuge | Labnet International | C0160-R | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher Scientific | A78300101 Issue 11 | |
| DMEM Cell Culture Media | Gibco | 11995-065 | Cell Biology grade |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | Cell Biology grade |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Jo Software | FlowJo, LLC | ||
| Forceps | Dumont | 0508-SS/45-PS-1 | Suitable for laboratory animal dissection |
| FITC-carboxylated latex beads | Sigma-Aldrich | L4530 | Cell Biology grade |
| GFP-P. aeruginosa | ATCC | 101045GFP | Suitable for cell infection assays |
| Glass bottom dish | MatTek Corp. | P35G-0.170-14-C | Cell Biology grade |
| High-Pressure Syringe | Penn-Century | FMJ-250 | Suitable for laboratory animal use |
| Homogenizer | Omni International | TH-01 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | Analytical grade |
| Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX73 | |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira | CA-2904 | Pharmaceutical grade |
| Shandon Kwik-Diff Stains | Thermofisher Scientific | 9990700 | Cell Biology grade |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425 | Molecular Biology grade |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1427 | Molecular Biology grade |
| MicroSprayer Aerosolizer | Penn-Century | IA-1C | Suitable for laboratory animal use |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagent grade |
| PBS | Gibco | 20012-027 | Cell Biology grade |
| rabbit anti-SRBC-IgG | MP Biomedicals | 55806 | Suitable for immuno-assays |
| rabbit anti-SRBC-IgM | Cedarline Laboratories | CL9000-M | Suitable for immuno-assays |
| Scissors | Miltex | 5-2 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | LS-2 | Suitable for laboratory animal use |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | BioRad | 1610301 | Analytical grade |
| Spring Scissors (Med) | Fine Science Tools | 15012-12 | Suitable for laboratory animal dissection |
| Spring Scissors (Small) | Fine Science Tools | 91500-09 | Suitable for laboratory animal dissection |
| sheep red blood cells (SRBCs) | MP Biomedicals | 55876 | Washed, preserved SRBCs |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | Molecular Biology grade |
| Xylazine | Akorn Animal Health | 59399-110-20 | Pharmaceutical grade |
References
- Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
- Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
- Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
- Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
- Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
- Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
- Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
- Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
- Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
- Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
- Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
- Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).
