Summary

Альвеолярных макрофагов фагоцитоза и распродажа бактерий в мышей

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Здесь мы приводим общие методы для анализа фагоцитарную функцию мышиных альвеолярных макрофагов и бактериальных Распродажа из легких. Эти методы исследования в пробирке фагоцитоз флуоресцеин Изотиоцианаты бусы и в естественных условиях фагоцитоз Pseudomonas aeruginosa зеленого флуоресцентного белка. Мы также описывают метод для очистки P. aeruginosa мышей.

Abstract

Альвеолярных макрофагов (AMs) гвардии пространство альвеолярных легких. Фагоцитоз, AMs играет решающую роль в обороне против вторгаясь патогенов, удаление омертвевших клеток или посторонних частиц и в резолюции воспалительных реакций и тканей ремоделирования, процессов, посредничестве различные поверхности рецепторы AMs. Здесь мы приводим методы для анализа фагоцитарной функции с помощью экспериментальных стратегий и в vitro и in vivo анализов различать шаблон признание рецептор-, рецептор комплемента- и гамма Fc рецептор опосредованный AMs фагоцитоз. Наконец мы рассмотрим метод, чтобы установить и характеризуют P. aeruginosa пневмонии модели мышей для оценки бактериальных Распродажа в естественных условиях. Эти анализы являются наиболее распространенными методами для оценки функции AM и может также использоваться для изучения функции макрофагов и бактериальных Распродажа в других органах.

Introduction

АПП являются крупные резидентов фагоцитов в альвеолах в стадии покоя и один из основных игроков врожденные иммунные реакции через признание и интернализации ингаляционных патогенов и инородных частиц1,2. Сообщалось, что AMs имеют важное значение для быстрого разминирования многих легочных патогены, например P. aeruginosa и клебсиеллы пневмонии3,4, так что дефицит в AM фагоцитоза часто приводит к респираторных инфекции, такие как острая пневмония, которые вызывают более высокие показатели смертности и заболеваемости.

АПП также инициировать врожденной воспалительные реакции в легких, производство цитокинов и chemokines например ФНО α, ИЛ 1β, какой уровень помех с другими клетками альвеолярного среды для производства chemokines и набирать воспалительных нейтрофилов, моноцитов, и Адаптивная иммунные клетки в легких5. Например ИЛ 1β, производимые AMs помогает премьер высвобождение нейтрофилов хемокиновых CXCL8 из эпителиальных клеток6. Кроме того АПП способствовать фагоцитоз apoptotic полиморфноядерных лейкоцитов (ПНЛ), отказ которых приводит к постоянной утечки внутриклеточных ферментов из ПНЛ окружающие ткани, что приводит к повреждению тканей и длительное воспаление 7 , 8 , 9.

Фагоцитоз, AMs опосредуется прямого признания патоген связанные молекулярные узоры на поверхности патогена шаблон признание рецепторов (ПРРС) АПП или привязки опсонизированными патогенов с рецепторами иммунной эффекторных АПП 10. для последнего, AMs может признать целей опсонизированными с иммуноглобулина (IgG) через их Fcγ рецепторы (FcγR) или патогенов с фрагментов комплемента, C3b и C3bi, через их дополнения рецепторов покрытием (CR)11. Среди дополнения рецепторов выборочно CR суперсемейства иммуноглобулинов (CRIg) выражается в ткани макрофагами12, и недавнее заключение подчеркнул роль CRIg в AM фагоцитоза в контексте P. aeruginosa пневмонии 13.

Многие оригинальные исследования использовать методы для оценки фагоцитоз макрофага описать молекулярных механизмов макрофагов функция14,15. Однако методы как в естественных условиях фагоцитоза требуют точную количественную оценку фагоцитоза. Здесь, мы суммируем подробная методология для фагоцитоза в vitro и in vivo, используя флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-стеклянные бусы и P. aeruginosa Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), соответственно. Кроме того мы объяснить метод дифференциации среди PRR-, CR- и FcγR опосредованной фагоцитоза. Наконец мы сообщаем метод характеризовать бактериальных Распродажа в мыши отношении P. aeruginosa пневмонии.

Protocol

Этот протокол следует принципам институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Восточной Вирджинии медицинской школы. 1. флуоресцентные бусинки фагоцитоз Усыпить мыши (C57BL/6J, 6 недель, женщины) CO2 удушение согласно IACUC протоколы для этического ?…

Representative Results

Мы впервые провели эксперимент, чтобы анализировать фагоцитоза, мышь первичной AMs. На протяжении всех анализов мы сравнили AMs, изолированные от WT и TRIM72KO мышей. Как показано на рис. 1А, микроскопии флуоресцирования показал что фагоцитоза FITC…

Discussion

При выполнении функции обмена газа, легких упорно противостоит посторонних частиц, патогенов и аллергенов. АПП обеспечивают первую линию обороны в силу их основная функция, а именно фагоцитоза. АПП также координировать с другими иммунные клетки в уничтожении патогенных микроорганизм?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается Грант R01HL116826 X. Zhao.

Materials

18-G Needle Nipro Medical  CI+1832-2C Molecular Biology grade
2,7-diaminofluorene (DAF) Sigma-Aldrich D17106 Molecular Biology grade
70% Ethanol Decon Labs Inc. 18C27B Analytical grade
96-well plate Corning 3603 Cell Biology grade
ACK lysis buffer Life Technologies A10492 Molecular Biology grade
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle Thermofisher Scientific Z23373 Molecular Biology grade
C5 deficient serum  Sigma-Aldrich C1163 Biochemical reagent
Centrifuge Labnet International C0160-R
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher Scientific A78300101 Issue 11
DMEM Cell Culture Media Gibco 11995-065 Cell Biology grade
FBS Atlanta Biologicals S11550 Cell Biology grade
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Flow Jo Software FlowJo, LLC
Forceps Dumont 0508-SS/45-PS-1 Suitable for laboratory animal dissection
FITC-carboxylated latex beads Sigma-Aldrich L4530 Cell Biology grade
GFP-P. aeruginosa ATCC 101045GFP Suitable for  cell infection assays
Glass bottom dish MatTek Corp. P35G-0.170-14-C Cell Biology grade
High-Pressure Syringe Penn-Century FMJ-250 Suitable for laboratory animal use
Homogenizer Omni International TH-01
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 Analytical grade
Inverted Fluorescence Microscope Olympus IX73
Ketamine Hydrochloride Hospira CA-2904 Pharmaceutical grade
Shandon Kwik-Diff Stains Thermofisher Scientific 9990700 Cell Biology grade
LB Agar Fisher Scientific BP1425 Molecular Biology grade
LB Broth Fisher Scientific BP1427 Molecular Biology grade
MicroSprayer Aerosolizer Penn-Century IA-1C Suitable for laboratory animal use
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Reagent grade
PBS Gibco 20012-027 Cell Biology grade
rabbit anti-SRBC-IgG  MP Biomedicals 55806 Suitable for immuno-assays
rabbit anti-SRBC-IgM  Cedarline Laboratories CL9000-M Suitable for immuno-assays
Scissors Miltex 5-2 Suitable for laboratory animal dissection
Small Animal Laryngoscope Penn-Century LS-2 Suitable for laboratory animal use
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) BioRad 1610301 Analytical grade
Spring Scissors (Med) Fine Science Tools 15012-12 Suitable for laboratory animal dissection
Spring Scissors (Small) Fine Science Tools 91500-09 Suitable for laboratory animal dissection
sheep red blood cells (SRBCs)  MP Biomedicals 55876 Washed, preserved SRBCs
Urea Sigma-Aldrich U5378 Molecular Biology grade
Xylazine  Akorn Animal Health 59399-110-20 Pharmaceutical grade

References

  1. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).
  2. Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease. Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).
  3. Broug-Holub, E., et al. Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival. Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).
  4. Knapp, S., et al. Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).
  5. Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).
  6. Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).
  7. Greenlee-Wacker, M. C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).
  8. Haslett, C. Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).
  9. Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).
  10. Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).
  11. Mosser, D. M., Zhang, X. Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  12. He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation. Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).
  13. Nagre, N., et al. Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).
  14. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  15. Su, H., Chen, H., Jen, C. J. Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).
  16. Amiel, E., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression. Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).
  17. Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).

Play Video

Cite This Article
Nagre, N., Cong, X., Pearson, A. C., Zhao, X. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (145), e59088, doi:10.3791/59088 (2019).

View Video