Bu çalışmada yenidoğan fareler için Probiyotikler gavaging kesin miktarda işlem ayrıntıları. Deneysel ayarı içerecek şekilde optimize edildi ama dozaj, yönetim yöntemleri ve bakterilerin bağırsak quantification probiyotik sınırlı değildir.
Yetişkin fare modelleri insanlarda hastalık ilerleme arkasında mekanizmasını anlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yetişkin fare modelleri Yenidoğan hastalıkları için yapılan çalışmalar uygulanabilirliği sınırlıdır. Hastalığın ilerlemesi, ana bilgisayar yanıt ve uzun vadeli etkisi ventilasyon müdahalelerin daha iyi anlamak için büyük olasılıkla bir yenidoğan fare modeli daha iyi bir seçimdir. Yenidoğan fare modelleri seyrek kullanımını kısmen bu küçük hayvanlarla çalışma teknik zorluklar bağlanabilir. Yenidoğan fare modeli gençliği yönetiminde probiyotik etkilerini belirlemek için ve özellikle yeni doğmuş fare bağırsak kolonizasyon kurmak yeteneği değerlendirmek için geliştirilmiştir. Özellikle, probiyotik kolonizasyon yenidoğan Mouse değerlendirmek için Lactobacillus plantarum (LP) yenidoğan fare gastrointestinal sistem doğrudan teslim edildi. Bu amaçla, LP fareler için Intra-yemek borusu (IE) sonda ile besleme besleme tarafından yönetiliyordu. Son derece tekrarlanabilir bir yöntem travma, bir yönü özellikle önemli kırılganlık yeni doğan farelerin verilen en aza indirirken bir doğru in probiyotik dozlarda yönetiminin IE gavaj sürecini standartlaştırmak için geliştirilmiştir. Sınırlamaları bu sürecin gavaged Eğer özofagus tahriş veya hasar ve aspirasyon olanakları içerir yanlış. IE gavaj distal yemek borusu içine aspirasyon azaltır çünkü bu yaklaşım mevcut uygulamaları üzerinde bir iyileştirme temsil eder. Sonda ile besleme nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ayıklanan bağırsak DNA ile LP belirli primerler kullanılarak probiyotik kolonizasyon profil takip ettiler. Farklı çöp ayarları ve kafes yönetim teknikleri kolonizasyon-yayılma potansiyeli değerlendirmek için kullanılmıştır. Protokol IE yenidoğan fare sonda ile besleme ve sonraki kolonizasyon miktar LP ile inceliklerini ayrıntılarını verir.
Bebeklerde, erken probiyotik poz azaltılmış enterokolit, atopik dermatit ve sepsis1,2,3, Nekroze edici gibi hastalıkların insidansı önde gelen immunomodulatory etkileri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir 4 , 5. ancak, bu immunomodulatory yanıt arkasında mekanizması keşfetmek için örnekleme için sınırlama yeni doğan insan denemeler (yani, sıralı kan berabere ve biyopsi) verilen zordur. Yenidoğan fare modelleri etki mekanizması probiyotik kullanımı ve bağırsak microbiota değişimler ile ilişkili neonatal bağışıklık yönetmelikte yer alan çalışma yardımcı olabilir. Ne yazık ki, çoğu fare modelleri için Probiyotikler büyük ölçüde yetişkin fareler üzerinde odaklanmıştır; Ancak, probiyotikler etkisini modelleri bu yaş grubu için belirli yararlı3,6olacak düşündüren hayatta erken yüksek olması muhtemeldir. Buna ek olarak, yenidoğan fare modelleri daha iyi hastalıklar ve uygulama, insan bebeklerin erken yaşamda daha yakından bir gelişmekte olan bağışıklık ve mikrobiyal sistem7,8 taklit etmek için beklendiği yönelik müdahaleler çalışmaya uygundur ,9,10. Ev sahibi ve onun microbiome arasında mekanik etkileşim odaklı bir yenidoğan farelerin probiyotik kolonizasyon desenleri ve ölçüde çalışmaya amacı oldu. Yeni doğan modelleri uygun açıklamaları literatürde bulunamadı ve böylece sağlam ve standart bir yöntem geliştirilmesi ihtiyacını ele alındı.
Yeni doğan fareler için çeşitli bileşiklerin sözlü yönetim kurulan yöntemleri anne sütü yoluyla istenen bileşikler transferini hamile barajlar11 için su kaynağı tedavi veya yönetimini kolaylaştırmak için besleme iğneleri kullanarak içerir istenen bileşenleri içine mastoidi12. Bu yöntemleri bu hassas dozaj gereksinimleri yoktur, nerede tedavi kolayca alıcı fare ile yutulur deneyleri için yararlıdır. Probiyotikler sık sık galactooligosaccharide ve fructooligosaccharide (FOS) bir probiyotik bakteriler için besin kaynağı olarak hizmet gibi bir prebiyotik ile birlikte uygulanmaktadır; Bu katkı bileşiklerin viskoz ve zorlu yolu ile yukarıda belirtilen yöntemleri yönetmek için çözüm olun. Prebiyotik ve probiyotikler kesin tutarları gerekli yaşam (DOL) ilk günkü gibi erken başladı yeni doğan fareler için yönetmek için bir yöntem oluşturulması. (Tedavi ve kontrol silah13,14,15,16arasında diğer probiyotik çalışmalarda gözlemlediği gibi) gavaj tekniği, kolonizasyon-yayılma olasılığı geliştirme süreci test edildi ve kolonize Lactobacillus plantarum (LP) ve yavrularını farklı sonda ile besleme programları ile bağırsak göreli bolluk değerlendirildi. Deneylerde kullanılan probiyotik hazırlık FOS (prebiyotik) ve maltodekstrin (kurtuluşu) ile son insan deneme3‘ te açıklandığı gibi karışık LP (ATCC 202195 zorlanma), gavaj başına 109 koloni oluşturan ünite (CFU) oluşuyordu. Probiyotik teslim IE sonda ile besleme kullanarak başarılı oldu ve işlem protokolü aşağıdaki ayrıntılı. Probiyotik kolonizasyon profil LP belirli primerler kullanılarak tüm bağırsaklar çıkarılan DNA amplifikasyon gerçek zamanlı kullanılarak değerlendirilmiştir.
IE sonda ile besleme yordamı bir probiyotik belirli bir doz yenidoğan fareler için güvenli bir şekilde yönetmek için geliştirilmiştir. Az miktarda sıvı besleme iğne aspirasyon dozajı teslimini güven sağlanması sırasında önlemek için kullanarak üst gastrointestinal sistem teslim edilir. Fareler bağırsağından kolonizasyon analiz iki için toplanmıştır ve altı gün sonda ile besleme sonrası. Yordamı DNA ekstraksiyon için probiyotik gram-pozitif organizmanın yüksek verim sağlamak için güncellenmiştir. QPCR analiz DNA’ın iki gün sonrası son gösterdi sonda ile besleme nispeten daha yüksek kolonizasyon LP farelerde gavaged fare gavaged ile karşılaştırıldığında her iki günde DOL 2-8 arasında her gün ayıklanır. Orada was da LP miktarında azalma altı gün boyunca, fare bağırsağından geçici bir organizmada olmak Bu probiyotik gösterilen. Bu deneylerin sonuçlarını araştırma bu yaş grubunda yüksek titizlik ile koşullarını oluşturmak.
Probiyotikler yenidoğan farelerde uzun vadeli etkileri gözlemlemek için yenidoğan farelere DOL 2 verildi; benzer bir başlangıç saatini insan mahkemeye gelin. Oropharyngeal yenidoğan fareler besleme literatürde daha önce açıklanan ve aspirasyon riski nedeniyle iyi gelişmiş bir yutma mekaniği düşük olduğunda daha DOL 5-812,17 sonra yapılmıştır. Aspirasyon daha yüksek oranda pilot çalışma (veri gösterilmez) gözlendi gibi ancak, oropharyngeal besleme DOL 2 fareler için uygun değildir. Viskoz doğa probiyotik ve prebiyotik çözüm aspirasyon riski ekledi. IE gavaging yordamı uygulamak istediğiniz birimin üst gastrointestinal sistem doğrudan teslim DOL 2 farelerde aspirasyon riskini en aza indirgemek. Yordamı başarısını ilk probiyotik sonda ile besleme infüzyon gıda boyası kullanarak doğrulandı. Gıda boyası yavru köpek deri yoluyla görünür bir işaretçi görevi görür. Olumsuz bir etkisi gavaged fareler yiyecek renklendirici gözlendi ve büyük ölçekli deneyler başlamadan önce bu şekilde gavaging yordam doğrulamak için önerilir. Gasping refleks görülme sonrası sonda ile besleme hızlı çözüm, başarılı bir sonda ile besleme için ek gösterge olarak da kullanılabilir. Fare Isıtma battaniye var yerleştirilen bir kez sonrası sonda ile besleme, gasping refleks azalacak ve 20 saniye içinde nefes frekans artış gözlenir. 30 saniye daha uzun süre gasping refleks devamı başarısız bir sonda ile besleme gösterir. Başarılı sonda ile besleme beslenme iğne uygun ekleme üzerinde şu mide kalp sfinkter açılış yukarıda oturan ampul ile de bağlıdır. Bu xiphoid süreci ve burun ucu arasındaki Uzunluk ölçme iğne üzerinde işaretleme gitmez ki fare burun sonda ile besleme sırasında sağlayarak kolaylaştırılabilir. Bu fare için yaralanma olasılığını en aza indirir. Sonda ile besleme sıklığı deneysel sonuçlar üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Sık sık gavaging-ebilmek da yaratmak belgili tanımlık pups ve belgili tanımlık kafes ve yuva sürekli pertürbasyon nedeniyle anne için daha fazla stres. En uygun sonda ile besleme gavages az sıktır ve zaman daha kısa bir süre içinde içinde belgili tanımlık sistem beklenen etkiyi kaybetmeden zamanlamadır. Emniyeti ve kısırlık yordam sonda ile besleme için iğne çamaşır ve ısıyla arasında kullanım tarafından sterilize gerekir. Bir fırçalayın ve iç su ısıyla gerekli olmadan kullanarak iğne herhangi bir kalan parçacıklar zorlama tarafından iğne ısıyla sırasında encrust ve gavaging yordam ile müdahale dış kullanarak üzerinde titizlikle yıkama.
Daha yüksek LP kolonizasyonu gavaged pups içinde gözlenen her gün pups gavaged her gün karşılaştırıldığında. Bu yavrular gavaged üzerinde azaltılmış stres nedeniyle her gün ve potansiyel olarak daha fazla besin yoluyla bu pups tarafından yutulur nispeten daha fazla süt elde probiyotik olabilir. Doz bağımlılık probiyotik tedavi daha önce fare modelleri18,19 ‘ okudu ve böylece doğru dozaj önemli bir ilçedir. Hazırlanan probiyotik çözüm doğru bir yönetilen CFU sayısını almak için her sonda ile besleme önce kaplama. Probiyotik organizma anaerobik ise, ne zaman tükenmesiyle veya anaerobik kültürlü CFU fark olup olmadığını görmek önemlidir. LP fakültatif anaerobe olduğu için her iki yöntem kullanarak kültürlü ve CFU hiçbir fark gözlendi.
Sonrası sonda ile besleme bağırsak LP yük analizi yapıldı qPCR ve yüksek kaliteli DNA örnekleri kullanarak. LP DNA kirlenme tedavi ve kontrol grubu arasında en aza indirmek için farklı iğneler, besleme Biyogüvenlik kabinleri ve cerrahî donanımlar en yüksek kaliteli örnekleri sağlamak için kullanılmıştır. Bağırsakta probiyotik doğru ölçüm en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon yöntemi gerekli. Dışkı DNA’ın çıkarılması için en verimli yöntem birden çok boncuk adımları20,21,22yenerek içerir. Bu yöntem bağırsak bakterileri boncuk atan kullanarak çıkarma için kabul ve azalmış temsil gözlenen (< kurtarılan 102 kopya) bütün bağırsak DNA ekstraksiyon plağın. LP bir Gram pozitif organizma peptidoglikan hücre duvarındaki önemli bir miktar ile olduğu gibi protokol peptidoglikan dağılması adımla lizozim23,24 enzimatik lizis arabelleğe eklendi kullanarak optimize edildi. Bu LP temsilciliği aynı bağırsak örnek iki kat daha büyük artış. Adım atan boncuk organizmanın lizis kolaylaştırır süre lizozim tedavi dış tabaka dağılması sağlar. Doku miktarını duruma getirilmesi, türü garnet boncuk ve boncuk kullanarak bozulma süresi PCR analizi yapmak için en uygun DNA ürünler elde etmek için gereklidir.
Profilaksi veya tedavi öncesi terim ve terim ventilasyon olarak yönetilen Probiyotikler olumlu etkisini son çalışmalar25,26,27,28içinde olduğunu göstermiştir. Probiyotikler için uygun yenidoğan fare modeli kurulması Probiyotikler koruyucu etkisi açmak için garanti kapsamındadır. Burada özetlenen bu protokolü yabancı araştırmacılar için bir rehber ile yenidoğan mouse iş Probiyotikler kullanarak temsil eder. İnsan sağlığı ve Hastalıkları Eğitim sırasında kemirgen microbiota sorunları rağmen bu yöntem microbiome Probiyotikler nedeniyle değişiklikleri anlamayla ilgili odaklı araştırma için genişletilebilir. Bu model ayrıca host-mikrop etkileşim ve bağışıklık yanıtı farklı gelişim dönemleri boyunca çalışmaya bir platform sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Hayvan bakım tesisi personeli sayesinde ve BC Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü Eğitim ve fare yardımcı olmak için UBC veterinerler iş. British Columbia Üniversitesi ve bölümü deneysel çalışma finansmanı için Tıp Fakültesi sayesinde.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |