本研究では、gavaging マウス新生仔にプロバイオティクスの正確な量のプロセスを詳しく説明します。実験の設定を含むように最適化されたが、プロバイオティクスの投与、管理の方法、腸内細菌の定量化に限定されていません。
成体マウスのモデルは、人間の病気の進行の背後にあるメカニズムを理解する広く使用されています。新生児疾患に成体マウス モデルで行われた研究の適用は、限られています。病気の進行、宿主反応と新生児における介入の長期的な影響を理解し、可能性が高い新生児マウス モデルはより良いフィットです。新生児マウス モデルのスパースの使用は、これらの小動物での作業の技術的な問題の一部に原因があります。新生児マウス モデルは、初期の生活のプロバイオティクス投与の効果を決定するため、特に新生児マウス腸管内で植民地を確立する能力を評価するために開発されました。具体的には、新生児マウスでプロバイオティクスの植民地化を評価するために乳酸菌(LP) は新生児マウス消化管に直接配信されました。このため、LP は強制経口投与 (IE) 内食道を介して供給することによりマウスに投与しました。外傷、新生仔マウスのもろさを与えられた特に重要な側面を最小限に抑えながらプロバイオティクス投与量の正確な管理を可能にする IE 強制経口投与のプロセスを標準化する再現性の高い方法を開発しました。このプロセスの制限は、場合 gavaged 食道炎症または損傷や誤嚥の可能性を含める誤って。遠位食道に IE を強制経口投与は誤嚥の可能性を低減するため、このアプローチは現在の慣行の改善を表します。次の強制経口投与、プロバイオティクスの植民地化のプロファイルは、LP 特異的プライマーと DNA を抽出し腸の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を使用してトレースされました。別の猫の設定とケージ管理技術は、植民地化普及の可能性を評価するために使用されました。プロトコルの詳細 IE 新生児マウス経口と LP とそれに続く植民地化定量の複雑さ。
乳児で早期プロバイオティクスが関連付けられている壊死性腸炎、アトピー性皮膚炎、敗血症1,2,3,のような病気の減少率につながる免疫調節効果4,5します。 ただし、この免疫調節応答の後ろのメカニズムは新生児の臨床試験 (すなわち、連続血液を描画および生検) でサンプリングに制限を与えられた探検に挑戦するです。新生児マウス モデルは、プロバイオティクスと腸内細菌叢の変化に関連付けられている新生児の免疫調節に関与する作用機序の研究を助けることができます。残念ながら、プロバイオティクスのほとんどのマウス モデルが大人のマウスの中心します。しかし、プロバイオティクスの影響は最初期の生活、この年齢別グループのために特定のモデルになります便利な3,6を示唆する可能性があります。また、新生仔マウス モデル、病気と人間の幼児の初期の人生のアプリケーション向けの開発微生物・免疫システム7,8 をもっと密接に模倣するどおり、介入研究に適しています ,9,10。目的は、範囲とホストとそのマイクロバイ間力学的相互作用にフォーカスを持つ新生児マウスのプロバイオティクスを植民地化のパターンを勉強することでした。新生児モデルの適切な説明は文献で見つけられなかったし、堅牢で標準化された方法の開発の必要性がこのように対処されました。
新生マウスにさまざまな化合物の経口投与の確立された方法には妊娠ダム11の水の源を扱うかの管理を容易にする餌針を使用して、牛乳を通じて必要な化合物の母体搬送が含まれます中咽頭の12に必要な化合物です。これらのメソッドは、正確な投与量の要件がないし、治療が受信者のマウスによって摂取されますすぐに実験に便利です。プロバイオティクス、プレバイオティクス ガラクトオリゴなどのプロバイオティクス細菌の栄養源としてフラクトオリゴ糖 (FOS) と組み合わせて投与されしばしばこれらの付加物は、粘性と上記の方法論による管理への挑戦に、ソリューションを行います。(DOL) の人生の最初の日が必要だったが早くも始まって新生児マウスにプロバイオティクスとプレバイオティクスの正確な量を管理するためのメソッドを考案します。(治療とコントロール アーム13,14,15,16の他のプロバイオティクス研究で観察)、強制経口投与法、植民地化普及の可能性を開発する過程でテストされたし、植民地化した乳酸菌(LP) 異なる強制経口投与スケジュールと子犬の腸内の相対的な豊かさが評価されました。実験で使用するプロバイオティクス製剤は、最近人間裁判3で説明した FOS (プレバイオティクス) とマルトデキストリン (賦形剤) 混合 LP (ATCC 202195 ひずみ) の強制経口投与あたり 109コロニー形成単位 (CFU) から成っていた。プロバイオティクス配信は IE 強制経口投与を使用して達成され、プロセスは、以下のプロトコルで説明します。プロバイオティクスの植民地化のプロファイルは、リアルタイムに LP 特異的プライマーを使用して全体の腸から抽出した DNA の増幅を使用して評価しました。
IE 強制経口投与の手順は、マウス新生仔にプロバイオティクスの特定の投与量を安全に管理するために開発されました。液体の少量は、自信で投与量の配達を確保しながらの吸引を防ぐために餌針を使用して上部消化管に配信されます。マウスの腸を植民地化解析 2 の採取、6 日後に強制経口投与。DNA の抽出のプロシージャは、プロバイオティクスのグラム陽性の有機体の高収量を確保するため変更されました。QPCR の DNA の分析抽出 2 日間ポスト最後強制経口投与を示した比較的高い植民地化 LP の gavaged マウスの gavaged マウスと比較してすべての 2 日間毎日 DOL 2-8 の間。またあった LP の量の減少 6 日間マウスの腸内の一時的な生物にこのプロバイオティクスを示します。これらの実験結果は、この年齢層の高い厳しさで研究を行うための条件を確立します。
DOL 2; マウス新生仔に投与された新生児マウスにおけるプロバイオティクスの長期効果を観察するには同様の開始時間は、ひと試験をポイントします。新生仔マウスの咽頭餌と、以前の文献に記載されて、行われている DOL 5 812,17後誤嚥のリスクがよく発達した嚥下力学に起因する低。ただし、咽頭の餌は適していません DOL 2 マウスの吸引率が高いパイロット研究 (データは示されていない) で認められました。プロバイオティクスとプレバイオティクスのソリューションが誤嚥のリスクに追加の粘性の性質。IE gavaging 手順に従うと、DOL 2 マウスの上部消化管に直接音量を提供しながら誤嚥のリスクが最小化されます。プロシージャの成功は、プロバイオティクスの経口注入食品着色料を使用してまず検証されました。食品着色料は、子犬の皮膚を通して見えるマーカーとして機能します。否定的な影響は認められなかったマウスの gavaged 食品着色料と、大規模実験を開始する前にこの方法で gavaging の手順を検証する勧めします。あえぎ反射見たポスト強制経口投与の迅速な解決は、成功した強制経口投与の追加のインジケーターとして使用できます。暖房毛布の上にマウスが配置される後強制経口投与、あえぎの反射が治まるし、呼吸の頻度の増加は 20 秒以内厳守します。30 秒より長くあえぎ反射の継続では、失敗した強制経口投与を示します。成功した強制経口投与は、胃の噴門括約筋の開口部の真上に座っている電球と餌針の適切な挿入によっても異なります。強制経口投与中に過去のマウスの鼻、剣状突起と、鼻の先端の間の長さを測定針のマーキングは行っていないことを確保することによって、これを促進することができます。これは、マウスへの損傷のチャンスを最小化します。強制経口投与の頻度は、実験結果の重大な影響を持つことができます。頻繁に gavaging も子犬とケージと巣の一定の摂動のため母親のためのより多くのストレスを作成できます。最適な強制経口投与スケジュールは、システムで期待される効果を失うことがなく、gavages、少なくとも頻繁に、時間の短い期間にわたってします。安全性とプロシージャの不妊、強制経口投与を確保するには、針は洗濯とオートクレーブ間使用で滅菌する必要があります。スクラブとオートクレーブが必要前に注射器を使用して針を通して水を強制的に任意の残りの粒子によって内部のオートクレーブ滅菌中に針に付着することができます gavaging プロシージャを妨げることができますを使用して、外部の徹底洗浄。
高い LP 植民地化は他のすべての gavaged された子犬で観察された日毎日子犬 gavaged と比較した場合。一日おきにし可能性のあるこれらの子犬が摂取すると比較的より多くのミルクをより多くの栄養素を得ることプロバイオティクス子犬 gavaged に減らされた圧力によりできます。プロバイオティクス治療の線量依存性は、以前マウス モデル18,19の研究されている、したがって適切な投与量の管理が重要です。準備プロバイオティクス ソリューションは、すべて強制経口投与 CFU の正確なカウントを取得する前にメッキです。プロバイオティクス有機体が嫌気性の場合 CFU 好気的または嫌気培養した場合で違いがあるかを参照してくださいすることが重要です。LP は、通性嫌気性菌は、それを両方の方法を使用して培養した、CFU で差は認められなかった。
ポスト強制経口投与腸 LP 負荷分析を行った qPCR で高品質の DNA サンプルを使用して。最小限の治療とコントロール グループの間 LP DNA 汚染餌針、異なるバイオ セーフティ キャビネット ・手術機器使用された最高品質のサンプルを確保するため。腸内のプロバイオティクスの正確な測定には、最適化された DNA 抽出法が必要な。便からの DNA の抽出のための最も効率的な方法は、手順20,21,22を破って複数のビードを含まれます。このメソッドはビーズの打撃を使用して腸内細菌の抽出のため採用し、減少した表現を観察 (< 102枚回復) 腸管の DNA の抽出の LP の。LP は細胞壁のペプチドグリカンの相当な量のグラムの肯定的な生物、リゾチーム23,24酵素換散バッファーに追加を使用して、ペプチドグリカン分解ステップ プロトコルを最適化しました。これは 2 つ以上同じ腸内サンプルの LP の表現を増加しました。リゾチーム処理は、有機物の溶解を容易にステップを破ってビード際に外側の層の溶解を確保します。組織の量の最適化、ガーネット ビーズの種類とビーズを使用して中断の期間、PCR 分析を実施する最適な DNA の製品を得るために必要なです。
プロバイオティクスとして予防や治療前の用語と用語の新生児管理の肯定的な影響は、最近研究25,26,27,28証明されます。プロバイオティクスの適切な新生児マウス モデルの確立は、プロバイオティクスの予防効果をアンパックする保証されます。ここで説明したこのプロトコルは、プロバイオティクスを用いた新生児マウス作業でなじみのない研究者のためのガイドを表します。人間の健康と病気を勉強しながら齧歯動物の腸に問題があるにもかかわらずこのメソッドはプロバイオティクスによるマイクロバイの変化を理解することに焦点を当てた研究を拡張できます。このモデルは、異なる発達段階にわたってホスト微生物間相互作用と免疫反応を研究するためのプラットフォームを提供します。
The authors have nothing to disclose.
動物介護老人施設スタッフにありがとうと訓練し、マウスの支援の UBC 獣医師仕事紀元前こども病院研究所。ブリティッシュ ・ コロンビアの大学と研究資金の実験医学に感謝します。
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |