تفاصيل هذه الدراسة العملية جافاجينج كميات محددة من البروبيوتيك للفئران حديثي الولادة. الإعداد التجريبية هو الأمثل لتشمل ولكن لا تقتصر على الكائنات الحية المجهرية الجرعات، أساليب الإدارة، والتقدير الكمي للبكتيريا في الأمعاء.
نماذج الماوس الكبار قد استخدمت على نطاق واسع فهم الآلية وراء تطور المرض في البشر. ويقتصر تطبيق الدراسات التي أجريت في نماذج الماوس الكبار لأمراض الأطفال حديثي الولادة. إلى فهم أفضل لتطور المرض واستجابات المضيف والأثر الطويل الأجل للتدخلات في الولدان، نموذج الفأر حديثي الولادة المحتمل تتناسب بشكل أفضل. استخدام نماذج الماوس الولدان متفرق يمكن أن يعزى جزئيا إلى الصعوبات التقنية للعمل مع هذه الحيوانات الصغيرة. وضع نموذج الولدان ماوس لتحديد آثار إدارة الكائنات الحية المجهرية في وقت مبكر من الحياة وعلى وجه التحديد تقييم القدرة على إقامة الاستعمار في الأمعاء الماوس حديثي الولادة. على وجه التحديد، لتقييم الاستعمار الكائنات الحية المجهرية في الماوس الأطفال حديثي الولادة، تم تسليم بلنتروم ملبنة (ليرة لبنانية) مباشرة في الجهاز الهضمي الماوس الأطفال حديثي الولادة. وتحقيقا لهذه الغاية، تدار ليرة لبنانية للفئران بالتغذية عن طريق تزقيمية مدتها (IE) داخل المريء. تم تطوير أسلوب استنساخه بدرجة عالية لتوحيد عملية تزقيمية IE تسمح إدارة دقيقة لجرعات بروبيوتيك مع التقليل من الصدمات، جانبا بالغ أهمية نظراً لهشاشة الفئران حديثي الولادة. وتشمل القيود هذه العملية إمكانيات تهيج المريء أو تلف وتطلع إذا جافاجيد بشكل غير صحيح. هذا النهج يمثل تحسنا عن الممارسات الحالية تزقيمية IE إلى المريء القاصي يقلل فرص الطموح. عقب تزقيمية مدتها، كان تتبع الشخصية الاستعمار للكائنات الحية المجهرية استخدام الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) من الحمض النووي المعوية المستخرجة مع الإشعال ليرة لبنانية محددة. إعدادات مختلفة من القمامة وتقنيات إدارة قفص استخدمت لتقييم احتمالات انتشار الاستعمار. تفاصيل البروتوكول تعقيدات تزقيمية الماوس الولدان IE والكمي الاستعمار اللاحقة مع ليرة لبنانية.
في الرضع والتعرض المبكر للكائنات الحية المجهرية ارتبطت مع آثار إيمونومودولاتوري مما أدى إلى انخفاض حالات الإصابة بأمراض مثل التهاب الأمعاء والقولون النّاخر، الاستشرائية والإنتان1،2،3، 4 , 5-إلا أن تحدي الآلية وراء هذه الاستجابة إيمونومودولاتوري لاستكشاف نظراً إلى القيد لأخذ العينات في التجارب البشرية حديثي الولادة (أي توجه الدم متسلسلة وخزعات). نماذج الماوس حديثي الولادة يمكن أن تساعد دراسة إليه العمل المشاركة في التنظيم المناعي حديثي الولادة المرتبطة باستخدام الكائنات الحية المجهرية، والتغييرات في الحجمية المعوية. لسوء الحظ، معظم نماذج الماوس البروبيوتيك ركزت إلى حد كبير على الفئران الكبار؛ بيد أن تأثير البروبيوتيك يرجح أن تكون أعلى في بداية الحياة، مما يوحي بنماذج محددة لهذه الفئة العمرية سوف تكون مفيدة3،6. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس حديثي الولادة أكثر ملاءمة لدراسة الأمراض والتدخلات الموجهة للتطبيق في الحياة المبكرة للرضع البشرية كما أنها من المتوقع أن تحاكي أوثق تطوير نظام المناعة والميكروبات7،8 ،،من910. وكان الهدف لدراسة مدى وأنماط الكائنات الحية المجهرية الاستعمار للفئران حديثي الولادة مع تركيز على ميكانيكية التفاعل بين البلد المضيف وأن ميكروبيومي. لم يتم العثور على وصف مناسب لنماذج الوليد في الأدب، وهكذا كان تناول حاجة إلى تطوير أسلوب قوي وموحد.
الأساليب المتبعة للإدارة عن طريق الفم من المركبات المختلفة للفئران حديثي الولادة تشمل نقل المركبات المطلوبة عن طريق حليب الأم بعلاج مصدر المياه للسدود الحوامل11 أو باستخدام الإبر التغذية لتسهيل إدارة المطلوب من المركبات إلى البلعوم12. هذه الأساليب مفيدة للتجارب التي لا تحتوي على متطلبات دقة الجرعة وحيث سهولة بلعها العلاج عن طريق الماوس المتلقية. وكثيراً ما تدار البروبيوتيك بالاقتران مع بربيوتيك مثل جالاكتوليجوساكتشاريدي وفروكتوليجوساكتشاريدي (المنحدر) التي تكون بمثابة مصدر للتغذية للبكتيريا بروبيوتيك؛ هذه المركبات المضافة تجعل الحل لزج وتحديا لإدارة عبر المنهجيات المشار إليها أعلاه. وضع أسلوب لإدارة كميات محددة من البروبيوتيك والبريبايوتكس للفئران حديثي الولادة ابتداء من أقرب وقت ضروري اليوم الأول من الحياة (DOL). عملية تطوير تقنية تزقيمية مدتها، إمكانية انتشار الاستعمار (كما لوحظ في دراسات أخرى الكائنات الحية المجهرية بين المعالجة ومراقبة الأسلحة13،14،،من1516) وقد تم اختبار والوفرة النسبية للمستعمر بلنتروم ملبنة (ليرة لبنانية) في أمعاء الجراء مع تزقيمية مختلف الجداول الزمنية المقررة. إعداد الكائنات الحية المجهرية المستخدمة في التجارب التي تتألف من الوحدات المكونة للمستعمرة9 10 (زيمبابوي) كل تزقيمية ليرة لبنانية (سلالة ATCC 202195)، مختلطة مع المنحدر (بربيوتيك) و maltodextrin (السواغ) كما هو موضح في المحاكمة البشرية الأخيرة3. وأنجز تسليم الكائنات الحية المجهرية باستخدام IE تزقيمية مدتها والعملية مفصلة في البروتوكول أدناه. تم تقييم الشخصية الاستعمار للكائنات الحية المجهرية استخدام الوقت الحقيقي تضخيم الحمض النووي المستخرج من الأمعاء كلها استخدام الإشعال ليرة لبنانية محددة.
ووضعت إجراءات تزقيمية IE بإدارة جرعة محددة من الكائنات الحية المجهرية الفئران حديثي الولادة بأمان. يتم تسليم كميات صغيرة من السائل إلى الجهاز الهضمي العلوي باستخدام إبرة تغذية لمنع تطلع مع ضمان إيصال الجرعة في الثقة. جمعت أمعاء الفئران لاستعمار تحليل اثنين وستة أيام بعد تزقيمية مدتها. تعديل الإجراءات المتعلقة باستخراج الحمض النووي لضمان عالية الغلة في الحي إيجابية الكائنات الحية المجهرية. قبكر تحليل الحمض النووي المستخرج يومين بعد آخر تزقيمية أظهرت أعلى نسبيا استعمار ليرة لبنانية في الفئران جافاجيد كل يومين بالمقارنة مع الفئران جافاجيد كل يوم بين دول 2-8. كان هناك أيضا انخفاضا قدرة ليرة لبنانية على مدى ستة أيام، عرض هذه الكائنات الحية المجهرية أن يكون كائن عابر في أمعاء الفأرة. نتائج هذه التجارب تهيئة الظروف اللازمة لإجراء البحوث مع دقة عالية في هذه الفئة العمرية.
لمراقبة آثار طويلة الأجل من البروبيوتيك في الفئران حديثي الولادة، كانت تدار بالفئران حديثي الولادة في دول 2؛ وقت بدء مماثلة تشير إلى المحاكمة البشرية. المكنسية تغذية الفئران حديثي الولادة هو الموصوفة سابقا في الأدب وقد نفذ إلا بعد12،DOL 5-817 عندما يكون خطر تطلع أقل بسبب ميكانيكا البلع متطورة. تغذية المكنسية غير مناسبة تماما للفئران 2 دول كما لوحظت معدلات أعلى من الطموح في الدراسة التجريبية (البيانات لا تظهر). طبيعة لزج حل بربيوتيك إضافة إلى مخاطر الاستنشاق والكائنات الحية المجهرية. اتباع الإجراء جافاجينج IE إلى أدنى حد خطر تطلع في الفئران DOL 2 بينما كان يلقي وحدة التخزين المطلوبة مباشرة إلى الجهاز الهضمي العلوي. وكان أولاً التحقق من صحة نجاح الإجراء استخدام تلوين الطعام غرست تزقيمية الكائنات الحية المجهرية. تلوين الطعام بمثابة علامة مرئية من خلال جلد ألجرو. أي آثار سلبية قد لوحظت في الفئران جافاجيد مع تلوين الطعام، ومن المستحسن للتحقق من صحة الإجراء جافاجينج بهذه الطريقة قبل بدء التجارب على نطاق واسع. يمكن استخدام القرار السريع من تزقيمية وظيفة المشاهدة منعكس تجمع أيضا كمؤشر إضافي تزقيمية ناجحة. حالما يتم وضع الماوس على بطانية تدفئة تزقيمية مدتها بعد، سوف تهدأ المعاكسة تجمع وسوف يلاحظ زيادة في وتيرة التنفس خلال 20 ثانية. استمرار المعاكسة تجمع لمدة أطول من 30 ثانية يشير إلى تزقيمية فاشلة. تزقيمية النجاح يعتمد أيضا على إدخال إبرة التغذية المناسبة مع لمبة يجلس الحق فوق فتح المصرة القلب المعدة. يمكن أن يتيسر ذلك بضمان أن الوسم على إبرة قياس طول بين عملية الرهابه وطرف الآنف، عدم تجاوز الآنف الماوس أثناء تزقيمية مدتها. وهذا يقلل من فرصة الإصابة بالماوس. تواتر تزقيمية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على النتائج التجريبية. جافاجينج المتكررة كما يمكن إنشاء مزيد من الضغط الجراء والأم بسبب اضطراب مستمر من القفص والعش. جدول تزقيمية المثلى عند أقل تواترا جافاجيس وخلال مدة أقصر من الوقت دون أن تفقد الأثر المتوقع في النظام. لضمان سلامة والعقم من الإجراء تزقيمية يجب تعقيم إبرة الغسيل والتعقيم الفترات الفاصلة بين استخدام. الغسيل صرامة على استخدام خارج فرك والداخل عن طريق إجبار المياه عن طريق الإبرة باستخدام حقنه قبل التعقيم ضروري كأي جزيئات بقايا يمكن انكروست على الإبرة أثناء التعقيم، ويمكن أن تتداخل مع الإجراء جافاجينج.
لوحظ أعلى LP الاستعمار في الجراء التي كانت جافاجيد مرة كل يوم بالمقارنة مع الجراء جافاجيد كل يوم. يمكن أن يكون هذا بسبب انخفاض الضغط على الجراء جافاجيد كل يوم، ويحتمل أن بروبيوتيك الحصول على المزيد من المواد الغذائية عن طريق بلعها من هذه الجراء الحليب أكثر نسبيا. التبعية جرعة من العلاج بروبيوتيك قد درست سابقا في الماوس نماذج18،19 وهكذا المهم إدارة الجرعة الصحيحة. هو مطلي الحل بروبيوتيك أعدت قبل كل تزقيمية للحصول على حصيلة دقيقة لزيمبابوى التي تديرها. إذا كان الكائن الحي بروبيوتيك اللاهوائية، من المهم لمعرفة ما إذا كان هناك فرق في زيمبابوي عند مثقف هوائيا أو لاهوائيا. ولما ليرة لبنانية أهوائي اختياري، هو مثقف باستخدام كلا الأسلوبين وكان يلاحظ أي اختلاف في زيمبابوي.
تم القيام بتحليل تحميل ليرة لبنانية المعوية وظيفة تزقيمية استخدام عينات الحمض النووي قبكر وعالية الجودة. لتقليل التلوث LP الحمض النووي بين العلاج ومجموعات المراقبة، مختلفة تغذية الإبر، خزانات السلامة البيولوجية والمعدات الجراحية واستخدمت لضمان أعلى جودة العينات. القياس الدقيق للكائنات الحية المجهرية في الأمعاء تتطلب طريقة استخراج الحمض النووي أمثل. الأساليب الأكثر كفاءة لاستخراج الحمض النووي من البراز ينطوي على عدة حبة ضرب الخطوات20،،من2122. هذا الأسلوب اعتمد لاستخراج البكتيريا المعوية باستخدام الضرب حبة ولاحظ تقلص التمثيل (< 10 نسخ2 المستردة) لليرة لبنانية في استخراج الحمض النووي كله الأمعاء. كما ليرة لبنانية كائن إيجابية غرام مع كمية كبيرة من peptidoglycan في جدار الخلية، كان تحسين البروتوكول مع خطوة حل بيبتيدوجليكان باستخدام ليسوزيمي23،24 إضافة إلى المخزن المؤقت تحلل الانزيمية. وهذا زاد تمثيل ليرة لبنانية في نفس العينة المعوية بأكبر من شقين. ويضمن معاملة lysozyme انحلال الطبقة الخارجية بينما حبة ضرب خطوة يسهل تحلل الكائن الحي. الأمثل لكمية من الأنسجة، نوع حبة العقيق وفترة انقطاع استخدام الخرز ضروري للحصول على منتجات الحمض النووي المثلى لإجراء تحليل PCR.
يدل على الأثر الإيجابي البروبيوتيك تدار كالوقاية أو العلاج في الولدان قبل الأجل والأجل في الدراسات الأخيرة25،26،،من2728. هناك ما يبرر إنشاء نموذج الفأر الوليد السليم البروبيوتيك فك تأثير وقائي من البروبيوتيك. يمثل هذا البروتوكول المبينة هنا دليل للباحثين غير مألوف مع عمل الماوس الولدان استخدام البروبيوتيك. على الرغم من المشكلات التي تحدث مع الحجمية القوارض أثناء الدراسة صحة الإنسان والمرض، ويمكن تمديد هذا الأسلوب للبحوث التي تركز على فهم التغييرات التي حدثت ميكروبيومي بسبب البروبيوتيك. هذا النموذج أيضا منبرا لدراسة التفاعل الميكروبات والمضيف والاستجابات المناعية على مدى مراحل إنمائية مختلفة.
The authors have nothing to disclose.
شكرا لموظفي “مرفق رعاية الحيوان” والبيطريين UBC للتدريب، والمساعدة في الماوس يعمل في معهد أبحاث مستشفى الأطفال قبل الميلاد. شكرا لجامعة كولومبيا البريطانية وإدارة الطب التجريبي لتمويل الدراسة.
1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |