播種性カンジダ症のハチミツガWaxworm 感染症モデル
Summary
ハチミツガは播種性カンジダ症の無脊椎動物モデルとして機能します。ここで、感染は詳細プロトコルし、モデルの有効性のサポート データを提供します。
Abstract
カンジダ菌は、皮膚、粘膜の表面や消化管を植民地化する人間の共通の真菌によってです。特定の条件下でカンジダも生命脅迫的全身感染症として、その関連する高死亡率の原因の調査の主要な焦点である粘膜感染症の衰弱の結果自然なニッチにはびこることができます。播種性感染症の動物モデルは、病気の進行を勉強してカンジダ病原性の特性を解剖します。これらのハチミツガwaxworm 感染モデルは全身の毒性の高スループットの調査のためコスト効果の高い実験的なツールを提供します。多く他の細菌と真核生物の感染エージェントは、広く受け入れられているモデル システムg. mellonella 、病原性を理解するために効果的に研究されている.まだ、 g. mellonellaに感染するために使用方法の変化は、表現型の結果を変更し、結果の解釈を複雑にできます。ここでは、利点と欠点の waxworm モデルを全身カンジダ発症機序を研究し、再現性を向上させる方法の詳細をまとめました。我々 の結果はg. mellonellaの死亡率を反応速度論の範囲を強調表示し、これらの速度を調節することができる変数を記述します。最終的には、このメソッドは、播種性カンジダ症モデルにおける病原性を研究する倫理的な迅速かつコスト効果の高い方法として立っています。
Introduction
カンジダ種は日和見病原体として浮上することができる共通の人間によって深刻な免疫不全と dysbiotic 患者。多くのカンジダ種は、病気を引き起こすことができます、 c. アルビカンス播種性カンジダ症1,2の最も一般的な原因です。C. アルビカンス以前制限ホスト壁のいずれかの直接浸透や施術部位と他3体の違反で導入を介して血流にアクセスするから全身疾患の結果します。カンジダは、粘い、バイオ フィルム形成、免疫細胞の脱税とエスケープ、および清掃4鉄を含むホスト内で全身の病気を引き起こす病原性プロセスの範囲を利用します。個々 の病原性のメカニズムを調査する生体外でのアプローチが存在しますが、動物モデルが病気結果5,6の全体を調査するための最良の選択肢を提供し続けます。前の研究は有望な体外体内7,8の再現に失敗した病原性の調査の多くのインスタンスを詳しく説明します。したがって、モデル動物病原性を評価する必要があります体内。ほとんどの疾患モデルは、自然共生9としてマウス システムを植民地化するC. albicans無力にもかかわらず人間の感染症のためのサロゲートとして機能するマウスに依存します。播種性カンジダ症の無脊椎動物モデル線虫線虫など、フルーツ ・ フライがショウジョウバエと waxwormハチミツガ、根本的な違いについての懸念基本的な生理学、曝露の経路とホストの体温、幅広く受け入れられている10、11.を妨げています。
最近、 g. mellonella waxworm 感染モデルはモデル病原性細菌、真菌病原体12,13,14の広い範囲に採用されています。このモデルの利点の比較的低コスト、増加のスループット、使いやすさでは、削減とマウスのモデルと比較して動物の善行に関する倫理的な問題です。研究者は、複数の変数、強い信頼区間より迅速な実験や動物のプロトコルのバイパスをテストする能力の増大につながります。G. mellonellaが臨床分離株11,15 全体バイオ フィルム形成、粘いと遺伝子制御に必要な遺伝子の摂動に続くc. アルビカンスの病原性を迅速に評価するためのプラットフォームとして提供しています ,16。最近の研究は、抗真菌性の薬の活動とそれ以外に挑戦し、時間のかかるである生体内で設定の下の抵抗の薬物動態を評価するためにg. mellonellaを用いた調査を取り入れています。17,18。G. mellonellaにおけるc. アルビカンスの病原性の研究が実験と異なる病原性表現型を作り出す研究グループ間の一貫性のないプロトコル内のバリエーションの伝えられる高レベルによって複雑になっているまだ、マウスおよび waxworms11,13,19,20,21。ここでは、病原性の実験により, C. albicans感染症,増加再現性を標準化しマウスにおける病原性の前述の研究との整合性を示すG. mellonellaプロトコルをまとめましたモデル。
以前の研究は、嵌合タイプのような染色体 5 (MTL) 軌跡C. albicansが細胞の識別と合う酵母や他の子嚢菌の菌類の22と同様の能力を調節することを示した。C. アルビカンス分離株の大半中央構造線 中央構造線とα 対立遺伝子(/αMTL)のそれぞれの 1 つをエンコードMTL遺伝子座でヘテロ接合体は、したがって滅菌15,23,24. loh または突然変異の損失MTL対立遺伝子の一つの喪失はホモMTL、または滅菌 ‘ホワイト’ 状態から表現型スイッチを受けることができる中央構造線α 系統につながる、有能な ‘不透明’ 状態25を交配します。前作はMTLヘテロ接合性消失また別の系統の背景26で全身感染症マウスモデルにおける病原性の減少することを強調しています。ここでは、 g. mellonellaの病原性にMTLをヘテロ接合性の貢献を描写する遺伝的に類似の実験セットを使用して播種性カンジダ症のg. mellonellaモデルを詳しく説明します。MTLα 系統だった/α に中央構造線と中央構造線の調査結果と同様の細胞の両方に関してより少なく劇毒性、 c. アルビカンスの病原性をMTL構成に影響を紹介します。内マウス感染モデル26。
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella waxworm モデルは、 c. アルビカンスの病原性の迅速かつ再現性の高い分析のための効果的なツールとして立っています。この詳細なプロトコルは、幼虫のバッチ間で同じサイトに定義されている伝染性の線量の一貫性のある配信に依存します。伝染性の線量は、初期の到着と受領日から 10 日間幼虫の使用生産同様の結果に対しG. mellonellaの死亡率に深い衝撃を持っ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、本研究で使用するためのハチミツガの取得でパメラ ワシントンとリア ・ アンダーソンの支援を認めると思います。
Materials
| Galleria mellonella | Snackworms.com | Buy twice as many worms as expected to use | |
| 10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe | Hamilton | 80000 | |
| Petri dish, 100X15 mm, 500 pack | Fisher | FB0875712 | |
| Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack | VWR | 87003-294 | |
| Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL | VWR | 97062-818 | |
| Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL | Millipore Sigma | EM-EX0276-1S | |
| autoclaved ddH2O |
References
- Kauffman, C. A., et al. Prospective multicenter surveillance study of funguria in hospitalized patients. The National Institute for Allergy and Infectious Diseases (NIAID) Mycoses Study Group. Clinical Infectious Diseases. 30 (1), 14-18 (2000).
- Horn, D. L., et al. Epidemiology and outcomes of candidemia in 2019 patients: data from the prospective antifungal therapy alliance registry. Clinical Infectious Diseases. 48 (12), 1695-1703 (2009).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clinical Microbiology Reviews. 20 (1), 133-163 (2007).
- Sardi, J. C., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
- Segal, E., Frenkel, M. Experimental in Vivo Models of Candidiasis. J Fungi (Basel). 4 (1), (2018).
- Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L. Animal models for candidiasis. Current Protocols in Immunology. 105, 11-17 (2014).
- Heymann, P., et al. The siderophore iron transporter of Candida albicans (Sit1p/Arn1p) mediates uptake of ferrichrome-type siderophores and is required for epithelial invasion. Infection and Immunity. 70 (9), 5246-5255 (2002).
- Priest, S. J., Lorenz, M. C. Characterization of Virulence-Related Phenotypes in Candida Species of the CUG Clade. Eukaryotic Cell. 14 (9), 931-940 (2015).
- Savage, D. C., Dubos, R. J. Localization of indigenous yeast in the murine stomach. J Bacteriol. 94 (6), 1811-1816 (1967).
- Ewbank, J. J., Zugasti, O. C. elegans: model host and tool for antimicrobial drug discovery. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 300-304 (2011).
- Amorim-Vaz, S., Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Examining the virulence of Candida albicans transcription factor mutants using Galleria mellonella and mouse infection models. Frontiers in Microbiology. 6, 367 (2015).
- Harding, C. R., Schroeder, G. N., Collins, J. W., Frankel, G. Use of Galleria mellonella as a model organism to study Legionella pneumophila infection. Journal of Visualized Experiments. (81), e50964 (2013).
- Jacobsen, I. D. Galleria mellonella as a model host to study virulence of Candida. Virulence. 5 (2), 237-239 (2014).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Hirakawa, M. P., et al. Genetic and phenotypic intra-species variation in Candida albicans. Genome Research. 25 (3), 413-425 (2015).
- Dunn, M. J., Kinney, G. M., Washington, P. M., Berman, J., Anderson, M. Z. Functional diversification accompanies gene family expansion of MED2 homologs in Candida albicans. PLoS Genetics. 14 (4), (2018).
- Astvad, K. M. T., Meletiadis, J., Whalley, S., Arendrup, M. C. Fluconazole Pharmacokinetics in Galleria mellonella Larvae and Performance Evaluation of a Bioassay Compared to Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for Hemolymph Specimens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
- Mesa-Arango, A. C., et al. The non-mammalian host Galleria mellonella can be used to study the virulence of the fungal pathogen Candida tropicalis and the efficacy of antifungal drugs during infection by this pathogenic yeast. Med Mycol. 51 (5), 461-472 (2013).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Fuchs, B. B., O’Brien, E., Khoury, J. B., Mylonakis, E. Methods for using Galleria mellonella as a model host to study fungal pathogenesis. Virulence. 1 (6), 475-482 (2010).
- Kavanagh, K., Fallon, J. P. Galleria mellonella larvae as models for studying fungal virulence. Fungal Biology Reviews. 24 (1-2), 79-83 (2010).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285 (5431), 1271-1275 (1999).
- Legrand, M., et al. Homozygosity at the MTL locus in clinical strains of Candida albicans: karyotypic rearrangements and tetraploid formation. Molecular Microbiology. 52 (5), 1451-1462 (2004).
- Lockhart, S. R., et al. In Candida albicans, white-opaque switchers are homozygous for mating type. Genetics. 162 (2), 737-745 (2002).
- Miller, M. G., Johnson, A. D. White-opaque switching in Candida albicans is controlled by mating-type locus homeodomain proteins and allows efficient mating. Cell. 110 (3), 293-302 (2002).
- Wu, W., Lockhart, S. R., Pujol, C., Srikantha, T., Soll, D. R. Heterozygosity of genes on the sex chromosome regulates Candida albicans virulence. Molecular Microbiology. 64 (6), 1587-1604 (2007).
- Herrero, A. B., et al. KRE5 gene null mutant strains of Candida albicans are avirulent and have altered cell wall composition and hypha formation properties. Eukaryotic Cell. 3 (6), 1423-1432 (2004).
- Hall, R. A., et al. The Mnn2 mannosyltransferase family modulates mannoprotein fibril length, immune recognition and virulence of Candida albicans. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003276 (2013).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Journal of Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and Immunity. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Lange, A., et al. Genome Sequence of Galleria mellonella (Greater Wax Moth). Genome Announcements. 6 (2), (2018).
- Krappmann, S. Lightning up the worm: How to probe fungal virulence in an alternative mini-host by bioluminescence. Virulence. 6 (8), 727-729 (2015).
- Chowdhary, A., Voss, A., Meis, J. F. Multidrug-resistant Candida auris: ‘new kid on the block’ in hospital-associated infections. Journal of Hospital Infection. 94 (3), 209-212 (2016).
- Delarze, E., Ischer, F., Sanglard, D., Coste, A. T. Adaptation of a Gaussia princeps Luciferase reporter system in Candida albicans for in vivo detection in the Galleria mellonella infection model. Virulence. 6 (7), 684-693 (2015).
