De wasmot Waxworm infectie Model voor verspreid Candidiasis

Summary

Wasmot fungeert als een ongewervelde model voor gedissemineerde candidiasis. Hier, we detail de infectie protocol en ondersteunende gegevens verstrekken voor de effectiviteit van het model.

Abstract

Candida -soorten zijn gemeenschappelijk schimmels commensals van de mens, de huid, de mucosal oppervlakken, en de maag-darmkanaal te koloniseren. Onder bepaalde voorwaarden, kan Candida hun natuurlijke gebieden resulterend in slopende mucosal infecties als goed als levensbedreigende systemische infecties, die een belangrijk aandachtspunt van onderzoek als gevolg van hun bijbehorende hoge sterftecijfers zijn overwoekeren. Dierlijke modellen van gedissemineerde infectie bestaan voor bestuderen van progressie van de ziekte en de ontrafeling van de kenmerken van Candida pathogeniteit. Van deze biedt de wasmot waxworm infectie model een kosteneffectieve experimentele rol voor high-throughput onderzoek van systemische virulentie. Vele andere bacteriële en eukaryote infectieuze agentia zijn effectief bestudeerd in G. mellonella te begrijpen van de pathogeniteit, waardoor het een algemeen aanvaarde modelsysteem. Variatie in de methode gebruikt voor het infecteren van G. mellonella kan echter veranderen van fenotypische resultaten en interpretatie van de resultaten bemoeilijken. We schetsen hier, de voordelen en nadelen van het model van de waxworm te bestuderen van systemische Candida pathogenese en een aanpak ter verbetering van de reproduceerbaarheid in detail te beschrijven. Onze resultaten wijzen op het bereik van sterfte kinetiek in G. mellonella en beschrijven van de variabelen die deze kinetiek moduleren kunnen. Deze methode staat uiteindelijk, als een ethische, snelle en kosteneffectieve benadering bestuderen de virulentie in een model van gedissemineerde candidiasis.

Introduction

Candida -soorten zijn gemeenschappelijke menselijke commensals die kunnen ontpopt zich als een opportunistische pathogenen in ernstig immuungecompromitteerde en dysbiotic patiënten. Hoewel veel Candida -soorten, leiden ziekte tot kan, is C. albicans de meest voorkomende oorzaak van gedissemineerde candidiasis^1,2. Systemische ziekten voortvloeit uit C. albicans toegang tot de bloedbaan via beide rechtstreekse penetratie van eerder restrictief host belemmeringen of introductie op chirurgische sites en andere inbreuken op het lichaam³. Candida -soorten maken gebruik van een aantal pathogene processen veroorzaken systemische ziekten binnen de host met inbegrip van filamentation, vorming van biofilms, immuun cel belastingontduiking en ontsnappen, en ijzer opruiming⁴. In vitro methoden bestaan om te onderzoeken van individuele pathogene mechanismen, maar dierlijke modellen blijven met de beste optie om te onderzoeken van het geheel van^5,6van de uitkomst van de ziekte. Eerder onderzoek heeft veel exemplaren van veelbelovende in vitro onderzoeken van virulentie bij gebreke te reproduceren in vivo^7,8gedetailleerd. Dus, dierlijke modellen zijn nog steeds vereist om te beoordelen van virulentie in vivo. De meeste modellen van de ziekte, is afhankelijk van muizen om te dienen als een surrogaat voor menselijke infecties ondanks C. albicans onvermogen om te koloniseren natuurlijk lymfkliertest systemen als een commensale⁹. Ongewervelde modellen van gedissemineerde candidiasis omvatten de nematode Caenorhabditis elegans, de vrucht vliegen Drosophila melanogaster, en de waxworm wasmot, hoewel bezorgdheid over fundamentele verschillen in de basis fysiologie, hebben host lichaam temperaturen en blootstellingswegen belemmerd hun brede acceptatie^10,11.

Recentelijk is de G. mellonella waxworm infectie model overgenomen aan model pathogeniteit van een breed scala van bacteriële en schimmelinfecties ziekteverwekkers^12,13,14. Voordelen van dit model zijn relatief lage kosten, hogere doorvoer opnemen, gebruiksgemak en verminderde ethische bezwaren met betrekking tot dierlijke weldadigheid ten opzichte van lymfkliertest modellen. Voor onderzoekers vertaalt dit in meer mogelijkheden voor het testen van meerdere variabelen, sterkere betrouwbaarheidsintervallen, snellere experimenten en bypass van dierlijke protocollen. G. mellonella heeft gediend als een platform voor het snel beoordelen C. albicans virulentie na verstoring van genen die vereist is voor de biofilm vorming, filamentation en gene verordening via klinische isolaten^{11,15 ,16}. Recente studies hebben opgenomen onderzoek van antischimmel werkzaamheid met behulp van G. mellonella te beoordelen van de farmacokinetiek van drug activiteit en weerstand onder in vivo instellingen die anders uitdagend en tijdrovend ^17,18. Nog, hebben studies van C. albicans virulentie in G. mellonella is bemoeilijkt door naar verluidt hoge niveaus van variatie binnen experimenten en inconsistent protocollen tussen onderzoeksgroepen die verschillende fenotypes van virulentie produceren tussen muizen en waxworms^{11,13,19,20,21}. Hier, schetsen we een G. mellonella protocol om te standaardiseren C. albicans infecties, verhoging van de reproduceerbaarheid in virulentie experimenten, en tonen van consistentie met eerder beschreven studie van virulentie in RattenUitrustingen modellen.

Vorige studies aangetoond dat het C. albicans type-achtige (MTL) locus op chromosoom 5 paring regelt cel identiteit en bevoegdheid vergelijkbaar met Saccharomyces cerevisiae en andere Ascomycota schimmels²²paring. De meerderheid van C. albicans isolaten zijn heterozygoot op de MTL locus, codering een van elk van de MTLeen en MTLα allelen (MTLeen/α), en zijn bijgevolg steriele^{15, 23 , 24}. verlies van één van de allelen MTL door verlies van heterozygoten (LOH) of mutatie leidt tot homozygoot MTLeen of MTLα stammen die kunnen ondergaan een fenotypische schakelaar van de steriele ‘witte’ staat aan de paring bevoegde ‘ondoorzichtig’ staat²⁵. Vorige werk heeft benadrukt dat verlies van MTL heterozygoten vermindert ook de virulentie in lymfkliertest modellen van systemische infectie over verschillende stam achtergronden²⁶. Hier, detail we de G. mellonella model voor gedissemineerde candidiasis met behulp van een genetisch gelijkaardige experimentele reeks verbeelden de bijdrage van MTL heterozygoten naar virulentie in G. mellonella. We laten zien dat MTL configuratie beïnvloed C. albicans pathogeniteit, waar MTLα stammen waren minder virulente met betrekking tot zowel MTLeen/α en MTLeen cellen, vergelijkbaar met de bevindingen model²⁶binnen lymfkliertest infectie.

Protocol

Alle methoden zijn afhankelijk van gebruik van ongewervelde gastheren en vereisen geen goedkeuring van institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC). 1. wasmot Waxworm larven De larven van de volgorde van groothandels en leveranciers die geen hormonen, antibiotica of andere behandelingen om de larven invoeren en die kunnen verzenden en leveren van levende specimens. Zorg ervoor dat alle larven kopen van dezelfde leverancier in de loop van experimenten. Wees…

Representative Results

Hier tonen we een reproduceerbare methode voor het gebruik van G. mellonella waxworms te onderzoeken van een gedissemineerde candidiasis model van infectie met C. albicans. De juiste opslag, onderhoud en selectie van larven voor infectie zijn kritische component reproduceerbaarheid te verzekeren in G. mellonella sterfte(Figuur 1). Gezonde larven, die actief zijn, hebben een lichte kleur geel/tan, en gebrek aan zwart…

Discussion

Het waxworm-model van G. mellonella staat als een effectief instrument voor de snelle en reproduceerbare analyse van C. albicans virulentie. Dit gedetailleerde protocol is gebaseerd op consistente levering van een gedefinieerde infectieuze dosis aan dezelfde site over een batch van larven. Infectieuze dosis heeft een diepgaande invloed op G. mellonella mortaliteit, terwijl gebruik van larven tussen hun eerste aankomst en tien dagen na ontvangst soortgelijke resultaten opgeleverd. Verlies van de…

Materials

Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O