Il modello di infezione del Waxworm di Galleria mellonella per candidosi disseminata

Summary

Galleria mellonella serve come un modello di invertebrati marini per candidosi diffusa. Qui, abbiamo dettaglio l’infezione protocollo e fornire dati di supporto per l’efficacia del modello.

Abstract

Specie di candida sono comuni fungine commensals degli esseri umani colonizzando superfici mucose, pelle e tratto gastrointestinale. In determinate condizioni, la Candida può Erbaiuto loro nicchie naturali conseguente debilitante infezioni delle mucose come bene come pericolose infezioni sistemiche, che sono degli obiettivi principali di indagine a causa di loro associati alti tassi di mortalità. Modelli animali di infezione diffusa esistano per studiare la progressione della malattia e le caratteristiche di patogenicità di Candida di dissezione. Di questi, il modello di infezione waxworm Galleria mellonella fornisce un conveniente strumento sperimentale per le indagini di alto-rendimento di virulenza sistemica. Molti altri agenti infettivi batterici ed eucariotici sono state studiate in modo efficace in g. mellonella capire patogenicità, che lo rende un sistema di modello ampiamente accettato. Eppure, variazione nel metodo utilizzato per infettare g. mellonella può alterare i risultati fenotipici e complicare l’interpretazione dei risultati. Qui, descriviamo i vantaggi e svantaggi del modello waxworm per studiare la patogenesi di Candida sistemica e un approccio per migliorare la riproducibilità di dettaglio. I nostri risultati selezionare l’intervallo di cinetica di mortalità in g. mellonella e descrivono le variabili che possono modulare questi cinetica. In definitiva, questo metodo si pone come un approccio etico, rapido e conveniente per lo studio di virulenza in un modello della candidosi diffusa.

Introduction

Specie di candida sono comuni commensals umano che sono in grado di emergendo come patogeni opportunisti in severamente immunocompromised e dysbiotic pazienti. Sebbene molte specie di Candida possono causare malattia, c. albicans è la causa più prevalente di candidosi diffusa^1,2. Malattia sistemica deriva da c. albicans l’accesso nella circolazione sanguigna tramite entrambi penetrazione diretta delle barriere restrittive precedentemente ospite o introduzione presso siti chirurgici e altre violazioni del corpo³. Candida specie utilizzano una gamma di processi patogeni per causare la malattia sistematica all’interno dell’ospite tra cui filamentazione, formazione di biofilm, l’evasione delle cellule immuni e fuga e ferro lo scavenging⁴. Esistono in vitro approcci per studiare i meccanismi patogeni individuali, ma modelli animali continuano a fornire la migliore opzione per indagare l’interezza di malattia risultato^5,6. La ricerca precedente ha dettagliato molte istanze della promettente indagini in vitro della virulenza non riuscendo a riprodurre in vivo^7,8. Così, modelli animali sono ancora necessari per valutare la virulenza in vivo. Maggior parte dei modelli di malattia si basano sui topi per servire come un surrogato per le infezioni umane nonostante albicans del c. impossibilità di colonizzare naturalmente sistemi murini come un commensale⁹. Invertebrati marini modelli della candidosi diffusa includono il nematode Caenorhabditis elegans, il frutto per volare Drosophila melanogastere la waxworm Galleria mellonella, anche se le preoccupazioni circa le differenze fondamentali in fisiologia di base, le temperature del corpo ospite e vie di esposizione hanno ostacolato la loro vasta accettazione^10,11.

Più recentemente, è stato adottato il modello di infezione di waxworm g. mellonella alla patogenicità di modello di una vasta gamma di patogeni batterici e fungini^12,13,14. Vantaggi di questo modello includono la relativamente basso costo, una maggiore produttività, facilitano d’uso e ridotto preoccupazioni etiche per quanto riguarda animali beneficenza rispetto ai modelli murini. Per i ricercatori, questo si traduce in una maggiore possibilità di testare più variabili, gli intervalli di confidenza più forti, più rapida sperimentazione e bypass dei protocolli degli animali. G. mellonella ha servito come una piattaforma per valutare rapidamente la virulenza di albicans del c. dopo perturbazione dei geni richiesti per regolamento di formazione, FILAMENTAZIONE e gene di biofilm in isolati clinici^{11,15 ,16}. Studi recenti hanno incorporato indagine dell’efficacia antifungina tramite mellonella g. per valutare la farmacocinetica di attività della droga e resistenza sotto impostazioni di in vivo , che sono altrimenti impegnativo e richiede tempo ^17,18. Ancora, gli studi della virulenza dei albicans del c. di g. mellonella hanno stati complicati da riferito alti livelli di variazione all’interno di esperimenti e protocolli incoerenti tra gruppi di ricerca che producono differenti fenotipi di virulenza tra topi e waxworms^{11,13,19,20,21}. Qui, descriviamo un protocollo mellonella g. per standardizzare i albicans del c. infezioni, aumento riproducibilità in esperimenti di virulenza e dimostrare la coerenza con gli studi precedentemente descritti della virulenza di murino modelli.

Gli studi precedenti hanno dimostrato che la c. albicans accoppiamento tipo-come (MTL) locus sul cromosoma 5 regola della microcella e accoppiamento competenza simile a Saccharomyces cerevisiae e altri di funghi ascomiceti²². La maggior parte degli isolati di c. albicans è eterozigotica del locus MTL , codifica uno di ciascuno degli MTLun e MTLα alleli (MTLun/α) e è di conseguenza sterile^{15, 23 , 24}. perdita di uno degli alleli MTL attraverso la perdita di eterozigosi (LOH) o mutazione conduce ad omozigotica MTLun o ceppi α MTLche possono subire un interruttore fenotipico dello stato sterile ‘bianco’ per la accoppiamento di stato competente ‘opaque’²⁵. Il lavoro precedente ha evidenziato che la perdita di eterozigosi MTL riduce anche virulenza in modelli murini di infezione sistemica per il ceppo diverso sfondi²⁶. Qui, abbiamo dettaglio il modello di g. mellonella per candidosi diffusa utilizzando un set sperimentale geneticamente simile per rappresentare il contributo di eterozigosi MTL alla virulenza in g. mellonella. Mostriamo che configurazione MTL influenzato albicans del c. patogenicità, dove MTLα ceppi erano meno virulenti rispetto al MTLun/α sia MTLun celle, simile ai risultati all’interno di infezione murina modello²⁶.

Protocol

Tutti i metodi descritti si basano sull’impiego di invertebrati marini padroni di casa e non richiedono l’approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC). 1. galleria mellonella Waxworm larve Larve di ordine da grossisti e fornitori che non introducono ormoni, antibiotici o altri trattamenti per le larve e che sono in grado di spedire e consegnare esemplari vivi. Essere sicuri di acquistare tutte le larve dallo stesso fornitore nel corso della sperime…

Representative Results

Qui, dimostriamo un metodo riproducibile per l’uso di waxworms g. mellonella per studiare un modello di candidosi diffusa di infezione usando c. albicans. Il deposito appropriato, la manutenzione e la selezione delle larve per infezione sono una componente fondamentale di assicurare la riproducibilità della mortalità mellonella g. (Figura 1A). Larve sane che sono attive, hanno una luce di colore giallo/tan, e patc…

Discussion

Il modello di waxworm g. mellonella si pone come strumento efficace per l’analisi rapida e riproducibile di virulenza di albicans del c. . Questo protocollo dettagliato si basa sulla distribuzione uniforme di una dose infettiva definita allo stesso sito attraverso un batch delle larve. Dose infettiva ha un profondo impatto sulla mortalità mellonella g. considerando che l’uso di larve tra loro arrivo iniziale e dieci giorni dal ricevimento prodotto risultati simili. Perdita dell’allele c. a…

Materials

Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O