Индукция кишечного трансплантата – versus – хост заболевания и его мини эндоскопическая оценки в живых мышей
Summary
Здесь мы представляем протокол, который описывает трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и позволяет повторяющихся мини эндоскопическая оценок дистальной части толстой кишки на месте для присутствия, характеристики и тяжесть воспаления кишечника в живой мышей, страдающих болезнью кишечного трансплантата – versus – хост.
Abstract
Острый трансплантат – versus – хост болезни (GvHD) представляет самое тяжелое осложнение что пациентов, перенесших ранее аллогенной гемопоэтических стволовых клеток трансплантации (Алло HCT) лица и часто ассоциируется с плохой клинических исходов. Хотя, например, проявления GvHD кожи обычно отвечают установленным иммунной супрессивной терапии и следовательно, не принимают роковой конечно, присутствие и интенсивность кишечных GvHD, особенно из середины к нижней части кишки, сильно влияют на результаты и общей выживаемости больных с острой GvHD. терапевтические возможности ограничиваются по существу классический подавляющих иммунную агентов, уступая только умеренной болезни смягчения эффектов. Следовательно, детальное знание о ткани резидентов иммунной Каскад, изменения в кишечную микрофлору, и стромальных ответ до, после и после кишечные заболевания GvHD срочно необходимы для понимания событий и лежащих в основе механизмов ее Патогенез и разрабатывать инновационные терапевтические возможности. Мышиных моделях GvHD часто используются для выявления и функционально оценки молекул и путей, предположительно вождения кишечных GvHD. Однако по существу отсутствуют средства специально контролировать и оценивать кишечного воспаления с течением времени с установленным баллов для оценки и класс острой GvHD обычно состоят из различных параметров, которые скорее отражают системного GvHD проявления. Подробной оценки кишечных GvHD был ограничен для исследования с использованием Усыпленных мышей, тем самым по существу за исключением продольной (т.е. кинетические) анализ толстой отсека под условие данного экспериментального (например, антитела опосредованной блокада провоспалительного цитокина) в живых мышей (то есть, в естественных условиях). Мини эндоскопическая на месте оценки дистальной части толстой кишки Лечение Алло HCT мышей, описанные здесь позволяет) подробную макроскопических оценку различных аспектов кишечного воспаления и b) параметр для сбора образцов ткани для вниз по течению анализов на различные моменты времени в течение периода наблюдения. В целом мини эндоскопическая подход обеспечивает крупный шаг вперед в доклинической неинвазивного мониторинга и оценки кишечных GvHD.
Introduction
Кроветворная злокачественных опухолей, непосредственно вытекающие из отсека гемопоэтических стволовых клеток и неконтролируемым, быстро прогрессирует и серьезные расстройства иммунной системы зачастую указания для выполнения Алло HCT1,2. Однако хотя приходится появление прогностические выгодно реакции трансплантат против опухоли, лимфоцитов доноров часто вызывая и содействие нежелательные иммунной системы нападения здоровых тканей компонентов в рамках Алло HCT получателя , процесс, который называется трансплантат – versus – хост болезни3. Проявления в кишечнике, так называемой кишечной GvHD, представляют собой наиболее ужасной осложнением острого GvHD, тяжелые формы, которые обычно связаны с высокой смертности1,2,4.
В целом, мышиных моделях Алло HCT появились как неоценимое значение для выявления и изучения иммунной опосредованного механизмов, лежащих в основе патогенеза GvHD5. Однако, кинетической оценки, например, благотворное влияние роман терапевтических вмешательств в живых мышей со временем обычно основывается на определение клинической GvHD счеты6. Хотя эти оценки подходят для отражения, например, общего бремени болезней (например, системного GvHD), клинической оценки отсутствие чувствительность к надежно зеркало органоспецифические проявления (например, в кишечнике). Следовательно выводы, например в том, что касается кишки защитные эффекты данной терапевтического вмешательства, которые основаны на этих скоринговых систем обычно не отвечают.
Несмотря на крупные достижения через изобретение Роман всего тела imaging условия в сочетании с использованием либо мыши генетических биолюминесцентных или флуоресцентные модели7,8, методологии непосредственно и конкретно оценить кишечные проявления GvHD в живых мышей хватает. Таким образом протокол эндоскопических оценки кишечных GvHD фенотип, описанные в следующем разделе объясняется преодолеть это препятствие. Кроме того, для уменьшения числа экспериментальных мышей с, пока что, подробную оценку сотовой, морфологические и молекулярные характеристики является мотивация (например, , гистопатология или молекулярной биологии) из кишечника GvHD проявление в конечном итоге требуется жертву экспериментально мыши.
Наше учреждение ранее сообщал о методологии мини эндоскопическая оценки кишечных проявлений в ходе сингенных колит модели9. В протоколе, представленные здесь, мы уточнить и скорректировать Колоноскопическая скоринга матрицы для ориентированных на alloresponse колит в живых мышей с кишечной GvHD после трансплантации аллореактивных HCT и доноров лимфоцитов в MHC класса я полностью несоответствующие установка . Мы определили четыре параметры, подходящие для отражения кишечника связанных с GvHD толстой поражений. Кроме того мы создали систему, которая позволяет доработать классификации любой один детерминант, что приводит к новым оценка, которая легко информирует читателя о тяжести кишечных GvHD присутствует в данной мыши на данный момент. Гистопатологические анализ подтвердил, что эндоскопическая оценка выше определенного порога надежно предсказывает умеренно высокий класс воспаление тканей. Следовательно мини эндоскопическая оценки, по-видимому, представляют рабочие заменой гистопатология золотой стандарт, который постоянно требует жертву экспериментальной мышей. Важно отметить, что этот протокол могут быть применены практически в любой точке данного времени и может использоваться многократно в течение болезни10,11. Кроме того, в отличие от использования биолюминесценции-зависит от подходов, требуются без труда интенсивных и длительных меры как основанные генетически изменены мышей и, следовательно, методология может применяться на практически любой мыши линии интерес.
Вместе взятые, учитывая пагубные клинические перспективы Алло HCT больных с тяжелой кишечных GvHD, быстрого научно-технического прогресса и более понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза иммунной срочно. Аналогичным образом важно, этические соображения требуют, что получение знаний должно быть достигнуто с использованием минимального числа экспериментальных мышей. Следовательно оба признали претензии на научно-исследовательское сообщество знакомства GvHD кишечника может быть достигнуто путем осуществления последовательных мини эндоскопическая оценок толстой кишки в цепочке экспериментальная работа для мониторинга и класс кишечных GvHD в живой экспериментального mouse модели, как описано и проверены в протоколе, представленные здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описывает методику индукции и мини эндоскопическая оценки толстой фенотипа, наблюдается в ходе кишечных GvHD. Он служит более широкое включение ученых для изучения кишечных GvHD продольно и неинвазивно (то есть, с самого начала толстой проявления и прогрессирования до максимальн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано совместных научно-исследовательских центров (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; проект B03) (для К.Х.) и CRC 1181 (CRC-DFG, проект B05) (для К.Х.), оба финансируемый Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
References
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).
- Ball, L. M., Egeler, R. M., Party, E. P. W. Acute GvHD: pathogenesis and classification. Bone Marrow Transplantation. 41, 58-64 (2008).
- Naymagon, S., et al. Acute graft-versus-host disease of the gut: considerations for the gastroenterologist. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14, 711-726 (2017).
- Zeiser, R., Blazar, B. R. Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation. Blood. 127, 3117-3126 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Anthony, B. A., Hadley, G. A. Induction of graft-versus-host disease and in vivo T cell monitoring using an MHC-matched murine model. Journal of Visualized Experiments. (66), e3697 (2012).
- Beilhack, A., et al. Prevention of acute graft-versus-host disease by blocking T-cell entry to secondary lymphoid organs. Blood. 111, 2919-2928 (2008).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1, 2900-2904 (2006).
- Buchele, V., et al. Targeting Inflammatory T Helper Cells via Retinoic Acid-Related Orphan Receptor Gamma t Is Ineffective to Prevent Allo-Response-Driven Colitis. Frontiers in Immunology. 9, 1138 (2018).
- Ullrich, E., et al. BATF-dependent IL-7RhiGM-CSF+ T cells control intestinal graft-versus-host disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 916-930 (2018).
- Kaplan, D. H., et al. Target antigens determine graft-versus-host disease phenotype. Journal of Immunology. 173, 5467-5475 (2004).
