在这里, 我们提出了一个协议, 描述异基因造血干细胞移植, 并允许重复的微内窥镜评估远端结肠原位的存在, 特点, 和严重程度的结肠炎症在生活患有肠道移植物抗宿主病的小鼠。
急性移植物抗宿主病 (gvhd) 是最严重的并发症, 患者以前接受异基因造血干细胞移植 (allo-hct) 的脸, 并经常与不良的临床结果。例如, 皮肤的 gvhd 表现通常对既定的免疫抑制疗法有反应, 因此, 没有采取致命的过程, 肠道 gvhd 的存在和强度, 特别是肠道的中下部,治疗方案基本上仅限于传统的免疫抑制剂, 只对轻度疾病的缓解作用。因此, 迫切需要详细了解组织驻场免疫级联、肠道微生物群的变化以及肠道 gvhd 发病前、肠前和肠道后的基质反应, 以了解其组织居民免疫级联的事件和机制。并开发创新的治疗方案。小鼠模型的 gvhd 经常被用来识别和功能评估分子和途径, 假定驱动肠道 gvhd。然而, 随着时间的推移, 专门监测和评估肠道炎症的手段基本上是缺乏的, 因为评估和评分急性 gvhd 的既定分数通常是由各种参数, 而反映了系统性 gvhd表现。肠道 gvhd 的详细评估仅限于使用安乐死小鼠的研究, 因此基本上排除了在特定实验条件下 (例如抗体介导) 结肠室的纵向 (即动力学) 分析在活小鼠 (即体内) 中阻断促炎细胞因子。这里描述的对所有 hct 治疗小鼠远端结肠的微型内镜原位评估允许: (a) 对肠道炎症的不同方面进行详细的宏观评估, b) 收集组织样本进行下游分析的选项, 可在观察期间的不同时间点。总体而言, 微型内窥镜方法为临床前无创监测和评估肠道 gvhd 提供了一项重大进展。
造血恶性肿瘤直接产生的造血干细胞室和不受控制的, 快速进展, 和严重的免疫介导的疾病往往是迹象, 执行全环 hct1,2。然而, 尽管考虑到预后有益的移植物抗肿瘤反应的发生, 供体淋巴细胞经常诱导和促进不需要的免疫介导的攻击健康组织成分在所有 hct 受者, 一个被称为移植物抗宿主病3的过程.肠道中的表现, 即所谓的肠道 gvhd, 是急性 gvhd 最可怕的并发症, 其严重的形式通常与高死亡率1,2,4有关。
总体而言, 小鼠的全聚 hct 模型已成为识别和研究免疫介导机制的宝贵工具, 其发病机制的 gvhd5。然而, 动态评估, 例如, 随着时间的推移, 新的治疗干预措施的有益效果活小鼠通常是基于临床 gvhd 分数6的测定。虽然这些分数适合反映, 例如, 整体疾病负担 (即系统的 gvhd), 临床得分缺乏敏感性, 以可靠地反映器官特定的表现 (例如,在肠道)。因此, 例如关于特定治疗干预措施的肠道保护作用的结论, 以这些评分系统为基础, 通常是不够的。
尽管通过发明新的全身成像模式, 结合生物发光或荧光遗传小鼠模型7,8的结合, 直接和具体的方法取得了重大进展活鼠肠道 gvhd 的评估缺乏。因此, 下一节描述的肠道 gvhd 表型内窥镜评估协议背后的理由是克服这一障碍。此外, 动机还包括减少实验小鼠的数量, 因为到目前为止, 对肠道 gvhd 的细胞、形态和分子特性 (例如,通过组织病理学或分子生物学) 进行了详细评估显化最终需要实验小鼠的牺牲。
我们的机构以前曾报告过在同一性结肠炎模型9 过程中对结肠表现进行小型内镜评估的方法。在这里介绍的协议中, 我们在 mhc 类的 mhc i 中移植同种异体 hct 和供体淋巴细胞后, 对肠道 gvhd 活小鼠的同种异体引起结肠炎的结肠镜评分矩阵进行了细化和调整.我们确定了四个参数, 适合反映肠道 GvHD-related 相关的结肠病变。此外, 我们还建立了一个系统, 允许对任何单个行列式进行微调分级, 从而产生一个新的分数, 很容易通知读者在给定时间点存在的肠道 gvhd 的严重程度。病理组织学分析证实, 超过一定阈值的内窥镜评分可靠地预测中、高级组织炎症。因此, 迷你内窥镜评估似乎是金标准组织病理学的有效替代品, 通常需要实验小鼠的牺牲。重要的是, 该协议几乎可以在任何特定的时间点应用, 并可在疾病发生过程中反复使用, 10、11.此外, 与使用与生物照明有关的方法不同的是, 不需要像转基因小鼠交叉这样的劳动密集和耗时的措施, 因此, 该方法几乎可以应用于任何小鼠。兴趣。
综合来看, 鉴于严重肠道 gvhd 患者的临床观点是有害的, 因此迫切需要快速的科学进步和对免疫发病机制背后的分子机制的更深入的了解。同样, 重要的、合乎道德的考虑要求, 应通过使用最少数量的实验小鼠来获得知识。因此, 通过在实验工作链中对结肠进行连续的微内窥镜评估, 对活体实验小鼠的肠道 gvhd 进行监测和分级, 可以提高研究界探索肠道 gvhd 的公认说法。模型, 如本文中提供的协议中所述和验证。
该方案描述了诱导和微型内镜评估的结肠表型观察过程中的肠道 gvhd。它的作用更广泛的目的, 使科学家能够研究肠道 gvhd 纵向和非侵入整个疾病过程 (即, 从结肠表现和进展的开始, 直到最大的疾病活动)。
然而, 实验者在将技术应用于各自的科学背景之前, 需要注意所提出的方法所固有的一些关键步骤和重要限制。首先, 虽然我们已经成功地使用了微型内窥镜评估肠道 GvHD-relate…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了合作研究中心 221 (CRC/TR221-DFG) 的支持, #324392634; 项目 b03) (至 k. h.) 和 crc 11181 (crc-dfg, 项目 b05) (至 k. h.), 均由德国妇女基金会 (德国研究基金会) 供资。
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |