Nous présentons ici un protocole qui décrit l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permet répétitives évaluations mini-endoscopique du côlon distal in situ pour la présence, les caractéristiques et gravité de l’inflammation du côlon dans live souris souffrant d’intestinal graft – versus – host disease.
Aiguë graft – versus – host disease (GvHD) représente la complication la plus sévère que les patients subissant déjà visage (allo-HCT) la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques et est souvent associée à un mauvais pronostic clinique. Certain temps, par exemple, des manifestations de greffon contre l’hôte de la peau sont généralement sensibles aux traitements immunitaire-suppressive reconnus et, par conséquent, ne prennent un cours fatal, la présence et l’intensité de la GVH intestinale, en particulier des pièces milieu-à-bas du tube digestif, fortement influencer le résultat et globalement la survie des patients atteints aiguë GvHD. options thérapeutiques sont essentiellement limitées aux agents immunitaire-suppressive classiques produisant seulement des effets modérés-atténuer les maladies. Ainsi, une connaissance détaillée sur la cascade immunitaire tissu-résident, les changements dans le microbiote intestinal et la réaction stromale avant, après et après l’apparition de GVH intestinale sont nécessaires d’urgence pour comprendre les événements et les mécanismes qui sous-tendent sa pathogénie et d’élaborer des options thérapeutiques innovantes. Modèles murins de greffon contre l’hôte sont souvent employées pour identifier et évaluer fonctionnellement les molécules et les voies présumément conduite GVH intestinale. Cependant, moyens spécifiquement, surveiller et évaluer l’inflammation intestinale dans le temps ne manquent essentiellement puisque les scores établis pour évaluer et GVH aiguë de grade sont systématiquement composées de divers paramètres qui reflètent plutôt la GvHD systémique manifestations. L’évaluation détaillée de la GVH intestinale a été limitée aux études en utilisant des souris euthanasiés, excluant ainsi essentiellement longitudinal (c.-à-d., cinétique) analyses du compartiment colique sous une condition expérimentale donnée (p. ex., médiée par les anticorps blocage d’une cytokine pro-inflammatoire) à des souris vivantes (c.-à-d. in vivo). L’évaluation in situe mini-endoscopique du côlon distal des souris traitées allo-HCT décrite ici permet une) une évaluation macroscopique détaillée des différents aspects de l’inflammation intestinale et b) la possibilité de recueillir des échantillons de tissus pour des analyses en aval à divers moments au cours de la période d’observation. Globalement, l’approche endoscopique mini fournit une avancée majeure dans le suivi non invasif préclinique et évaluation de GVH intestinale.
Malignités hématopoïétiques qui résultent directement du compartiment de cellules souches hématopoïétiques et incontrôlée, progresse rapidement et graves troubles immunitaire sont souvent des indications pour effectuer des allo-HCT1,2. Cependant, bien que représentant l’apparition de la réponse de graft-versus-tumeur bénéfique pronostique, lymphocytes du donneur sont fréquemment induisant et promouvoir une attaque immunitaire indésirable des composants des tissus sains dans le destinataire allo-HCT , un processus qui est appelé graft – versus – host disease3. Manifestations dans le tube digestif, le soi-disant GVH intestinale, représentent la complication la plus redoutée du greffon contre l’hôte aiguë, des formes sévères qui sont systématiquement associées à une mortalité élevée1,2,4.
Modèles dans l’ensemble, murins de allo-HCT sont devenus des outils précieux pour identifier et étudier les mécanismes à médiation immunitaire qui sous-tendent la pathogénie du greffon contre l’hôte5. Cependant, cinétique évaluation de, par exemple, les effets bénéfiques de nouvelles interventions thérapeutiques au fil du temps chez les souris vivent régulièrement repose sur la détermination du greffon contre l’hôte clinique scores6. Alors que ces scores sont adaptés afin de tenir compte, par exemple, la global de morbidité (c’est-à-dire la GvHD systémique), clinique scores manque la sensibilité en miroir avec fiabilité les manifestations spécifiques d’organes (par exemple, dans le tube digestif). Par conséquent, conclusions, par exemple en ce qui concerne les effets de protection intestinale d’une intervention thérapeutique donnée, qui reposent sur ces notation systèmes habituellement tombent à courtes.
Malgré des avancées importantes grâce à l’invention de nouveaux corps modalités en combinaison avec l’utilisation de deux souris génétique bioluminescent ou fluorescent modèles7,8, directement et spécifiquement des méthodes d’imagerie évaluer l’intestin manifestation du greffon contre l’hôte chez les souris vivantes font défaut. Par conséquent, la raison d’être du protocole de l’évaluation endoscopique du phénotype GVH intestinale décrit dans la section suivante est de surmonter cet obstacle. En outre, la motivation est également de réduire le nombre de souris expérimental puisque, jusqu’à présent, une évaluation détaillée des caractéristiques morphologiques, cellulaires et moléculaires (p. ex., par histopathologie ou en biologie moléculaire) de GVH intestinale manifestation a finalement exigé le sacrifice de la souris de laboratoire.
Notre institution a précédemment rapporté sur la méthodologie d’une évaluation des mini-endoscopique des manifestations du côlon au cours de colite syngénique modèles9. Dans le protocole présenté ici, nous avons affiné et adapté le coloscopique marquant la matrice axée sur l’alloresponse ulcéro-hémorragique dans des souris vivantes avec GVH intestinale après transplantation d’alloréactives HCT et donateurs des lymphocytes dans une MHC classe j’ai totalement incompatibles réglage . Nous avons identifié quatre paramètres appropriés pour tenir compte des lésions coliques intestinales axés sur le greffon contre l’hôte. En outre, nous avons établi un système qui permet un classement affiné de n’importe quel déterminant unique, résultant en une nouvelle partition qui facilement informe le lecteur sur la sévérité de la GVH intestinale présente une souris donnée à un moment donné. Les analyses histopathologiques confirment qu’un score endoscopique dépassant un certain seuil est fiable prédire une inflammation des tissus grade modéré à élevé. Il appert donc qu’évaluation endoscopique mini pour représenter un substitut de travail pour l’histopathologie de l’étalon-or qui exige régulièrement le sacrifice des souris expérimentales. Ce qui est important, ce protocole peut être appliqué à pratiquement n’importe quel moment donné et peut être utilisé à plusieurs reprises au cours de la maladie10,11. En outre, contrairement à l’utilisation d’approches axées sur la bioluminescence, aucune mesure de travail intense et longue comme intercrossing génétiquement des souris modifiées n’est nécessaires et, par conséquent, la méthodologie peut être appliquée sur pratiquement n’importe quelle lignée de souris de intérêt.
Pris ensemble, étant donné le point de vue clinique néfaste des allo-HCT diabétiques GVH intestinale sévère, progrès scientifique rapide et mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie immunitaire sont urgent. De même, considérations éthiques importantes exigent que le gain de la connaissance devrait être réalisé avec l’utilisation du nombre minimal des souris de laboratoire. Ainsi, tous les deux reconnu réclamations sur la communauté de recherche explorant la GVH intestinale peuvent être avancées en mettant en œuvre des évaluations endoscopique mini séries du côlon dans la chaîne de travail expérimental pour surveiller et GVH intestinale chez des souris expérimentale direct de grade modèles, tel que décrit et validés dans le protocole présenté ici.
Le protocole décrit la méthode d’induction et évaluation mini-endoscopique du côlon phénotype observé au cours de la GVH intestinale. Il a pour objectif plus large de permettre aux scientifiques d’étudier la GVH intestinale longitudinalement et non invasive au cours de toute maladie (c’est-à-dire, dès le début de la manifestation du côlon et de la progression jusqu’à l’activité maximale de la maladie).
Cependant, il y a certaines étapes critiques et des limitations importan…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par le centres de collaboration de le recherche (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, 324392634 # ; projet B03) (de K.H.) et CRC 1181 (CRC-DFG, projet B05) (K.H.), tous deux financement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, fondation de recherche allemande).
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |