マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓フローサイトメトリーを用いた排水における制御性 T 細胞サブセットの定量
Summary
ここで、マウス胸腺、膵リンパ節および脾臓の研究をするこれらの細胞をフローサイトメトリーを排水から単一セルを準備するためのプロトコルを提案する.さらに、このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いた T 細胞のサブセットを決定するため使用されました。
Abstract
私たちの免疫システムは数と制御性 T 細胞 (Treg) 細胞を含む免疫細胞の多様性から成っています。Treg 細胞は末梢誘導 Treg (pTreg) 細胞、胸腺派生 Treg (tTreg) 細胞 2 つのサブセットに分けることができます。彼らは私たちの体のさまざまな器官に存在しており、ヘリオスなどニューロピリン 1 の特定のマーカーで区別することができます。TTreg 細胞 pTreg 細胞よりもより機能的に抑制されることが報告されています。したがって、異種細胞集団を調査するとき、tTreg と pTreg の両方の細胞の割合を調べることが重要です。ここで、フローサイトメトリーを用いた pTreg 細胞 tTreg 細胞を区別するために normoglycemic 非肥満糖尿病マウスから、胸腺腺、膵ドレイン リンパ節および脾臓を集めました。手動でこれらの器官からの単一細胞懸濁液をご用意しました。螢光色素共役表面 CD4, CD8, CD25 とニューロピリン 1 抗体を用いて細胞を染色します。彼らは一晩冷蔵庫で保管されました。次の日セルは共役螢光色素細胞内の Foxp3 とヘリオスの抗体で染色しました。これらのマーカーは、Treg 細胞の 2 つのサブセットの特性評価に使用されました。このプロトコルは、単純かつ実用的なマウス胸腺、膵リンパ節および脾臓を排水から単一セルを準備し、その後フローサイトメトリーによる解析のために使用する方法を示します。
Introduction
(Treg) T 細胞は免疫系の恒常性のために重要です。Treg 細胞は CD4 細胞表面抗原の発現と CD25、および転写因子フォーク ヘッド ボックス P3 (Foxp3)1,2,3によって定義されます。坂口らはまず、CD25 はマウス4、Treg 細胞を識別するための先駆的な観察を提供する T サプレッサー細胞の発現を示したことを示した。Treg 細胞さまざまな誘発アポトーシス、サイトカイン消費と細胞毒性の発現を抑制する granzymes の分泌を介して細胞崩壊を含むメカニズムを介して抑制能力を出すことによって免疫寛容で中心的な役割を再生します。T リンパ球抗原 45。さらに、成長因子 β (TGF-β)、インターロイキン 10 (IL-10) と IL-355変換など抑制性サイトカインを分泌することができます彼ら。Treg 細胞自然から派生できる胸腺胸腺の派生 (tTreg) Treg 細胞を指定されている場合、または場合は末梢細胞 Treg (pTreg) と呼ばれる、末梢臓器で誘導されることができます。
ヘリオス、イカロス転写因子ファミリーのメンバー報告された tTreg 細胞間の区別のマーカーと pTreg 細胞6。後、他の 2 つのグループは、セマフォリン III の受容体ニューロピリン 1 (Nrp1) が特定の条件7,8下 tTreg 細胞の表面マーカーとして役立つことができることを報告しました。それにもかかわらず、シンらはヘリオスが素朴なマウス9でこの文脈でより良いマーカーであることを示しています。
Treg 細胞のサブセットは、免疫系の恒常性維持、自己免疫や感染症に対する保護に極めて重要な役割を果たします。したがって、番号とリンパ系およびリンパ系組織でのこれらの人口の割合を決定することが重要です。これを達成するには、1 つはこれらの器官からの単一細胞懸濁液を準備するが。プロトコルの番号説明または以前の研究で使用されました。主に、自動 dissociators は、以前に発行されたレポート10,11で使用されています。自動 dissociators を使って使いやすく、時間の節約、それは高価な手順です。したがって、normoglycemic 非肥満の糖尿病 (NOD) マウス、およびこれらの器官から孤立 1 細胞からマウス胸腺腺、膵ドレイン リンパ節 (PDLNs) と脾臓から単一細胞懸濁液を準備する手動の方法を使いました。このメソッドは、我々 の以前の研究で使用されている、我々 は手動で単一細胞懸濁液を準備する方法は自動分解方法9,12,13,14と同じくらい効率的発見します。さらに、CD4 の割合を決定するためフローサイトメトリーを用いて+CD8–CD25+Foxp3+ Treg 細胞 tTreg と pTreg の細胞の細胞と Treg のサブセット。TTreg 細胞のマーカーとしてヘリオスと Nrp1 を使用して tTreg と pTreg の細胞が区別されていました。したがって、我々 の結果を示す、単一のセルを準備するための手動の方法は効率的に働き、フローサイトメトリーを用いた研究の準備の単一細胞懸濁液をさらに使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、胸腺腺、PDLNs、NOD マウスの脾臓から単一細胞を分離し、ヘリオスと cd4 Nrp1 の発現を調べた+CD8–CD25+Foxp3+ Treg 細胞のフローサイトメトリーを用いたします。本研究ではタイプ 1 の糖尿病のマウスモデルである NOD マウスは使用されました。以前の研究では、ヘリオスまたは Nrp1 が pTreg 細胞 tTreg 細胞を識別するための良いマーカーであるかどうか?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、スウェーデン研究評議会、EXODIAB、スウェーデン糖尿病財団、スウェーデンの子供糖尿病基金、SEB Diabetesfonden、o. e. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse によって財政上支えられました。著者は、彼らのサポートとの議論のおかげでオーラあたりカールソンとステラ サンドラーにたいと思います。
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
References
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
