Summary

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

Published: February 27, 2019
doi:

Summary

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

Abstract

המערכת החיסונית שלנו מורכב מספר ומגוון של תאים חיסוניים כולל הרגולציה ותאי T תאים (Treg). Treg תאים מתחלקים שתי קבוצות משנה, תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי ותאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה. הם נמצאים איברים שונים של הגוף שלנו, ניתן להבחין באמצעות סמנים ספציפיים, כגון הליוס ו- Neuropilin 1. בעבר דווח כי תאים tTreg הם באופן פונקציונלי יותר מדכא מאשר תאים pTreg. לכן, חשוב לקבוע את הפרופורציה של תאים הן tTreg והן pTreg, כאשר חוקרים אוכלוסיות הטרוגניות תא. במסמך זה, אספנו הרתי בלוטות לימפה המנקזים הלבלב, טחולים מ normoglycemic בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים להבחין tTreg תאים מתאי pTreg באמצעות cytometry זרימה. הכנו באופן ידני את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. Fluorochrome מצומדת CD4 משטח, CD8, CD25, נוגדנים Neuropilin 1 שימשו כדי להכתים את התאים. הם נשמרו במקרר למשך הלילה. ביום הבא, התאים היו מוכתמים נוגדנים Foxp3 ואת הליוס תאיים fluorochrome מצומדת. סמנים אלה שימשו כדי לאפיין את שתי קבוצות משנה של תאים Treg. פרוטוקול זה מדגים דרך פשוטה אך מעשית כדי להכין תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול, להשתמש בהם עבור ניתוח cytometric תזרים עוקבות.

Introduction

הרגולציה ותאי T (Treg) הם קריטיים עבור הומאוסטזיס של מערכת החיסון. Treg תאים מוגדרים על-ידי הביטוי של פני השטח אנטיגנים CD4 ו CD25 ולאחר שעתוק מקדם forkhead P3 תיבת (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. קודם הראה כי CD25 מתבטאת צורונים על תאי T משתיק קול עכברים4, אשר סיפקה תצפית חלוצית לצורך זיהוי תאים אנושיים Treg. תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי סובלנות המערכת החיסונית מצידה בעל יכולת מדכאים באמצעות מגוון של מנגנונים, כולל cytolysis באמצעות ההפרשה של granzymes כדי לגרום אפופטוזיס, צריכת ציטוקין וניגוד דרך הביטוי של ציטוטוקסיות לימפוציטים-T אנטיגן 45. בנוסף, הם יכולים להפריש ציטוקינים מעכבות כגון הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), אינטרלויקין-10 (IL-10) ו- IL-355. Treg תאים באופן טבעי הנגזרות התימוס, ובמקרה הזה והם מיועדים תאים Treg (tTreg) נגזר הרתי, או שהם יכולה להיגרם באיברים ההיקפיים באותו מקרה נקראים תאים Treg (pTreg) באופן עקיף המושרה.

הליוס, חבר של משפחת פקטור שעתוק Ikaros, דווח כדי להיות סמן להבחנה בין תאים tTreg, pTreg תאים6. מאוחר יותר, שתי קבוצות אחרות דיווחו כי Neuropilin 1 (Nrp1), קולטן השלישי semaphorin, יכול לשמש כסמן משטח של תאים tTreg תחת תנאים מסוימים,7,8. למרות זאת, סינג ואח הראו כי הליוס הוא סמן טוב יותר בהקשר זה נאיבי עכברים9.

קבוצות משנה של תאים Treg לשחק תפקיד מרכזי שמירה על הומאוסטזיס מערכת החיסון, הגנה מפני מחלת חיסון עצמי ולדלקת. לכן, חשוב לקבוע את המספרים ואת הפרופורציות של אוכלוסיות אלה ברקמות הלימפה והן הלא-הלימפה. כדי להשיג זאת, יש להכין את המתלים תא בודד מן האיברים האלה. מספר פרוטוקולים המתוארים או בשימוש במחקרים קודמים. בעיקר, dissociators אוטומטי שימשו דוחות שפורסמו בעבר10,11. שימוש dissociators אוטומטי הוא נוח והוא חסכון בזמן, אבל זה הליך יקר. לכן, השתמשנו בשיטה ידנית כדי להכין המתלים תא בודד מאתר בלוטות הרתי, הלבלב ניקוז הלימפה (PDLNs), טחולים normoglycemic (הנד) שאינו שמנים בעכברים סוכרתיים, תאים בודדים מבודדת מן האיברים האלה. בשיטה זו נעשה שימוש במחקרים קודמים שלנו ומצאנו כי השיטה הידנית להכנת התליה תא בודד הוא יעיל כמו dissociator אוטומטי שיטה9,12,13,14. יתר על כן, השתמשנו cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של CD4+CD8CD25+Foxp3+ Treg תאים, תת-קבוצות של Treg תאים תאים tTreg ו- pTreg. התאים tTreg ו- pTreg היו מכובדים באמצעות הליוס Nrp1 כסמני תא tTreg. לכן, התוצאות שלנו עולה כי השיטה הידנית עבור הכנת את התאים לעבוד בצורה יעילה המתלים מוכן תא בודד יכול לשמש עוד יותר עבור מחקרים באמצעות cytometry זרימה.

Protocol

ועדת האתיקה בעלי חיים מקומיים באוניברסיטת אופסלה אישרה את הניסויים בבעלי חיים. 1. קצירת איברים מבעלי חיים להקריב את העכברים מאת נקע בצוואר הרחם. מקום בלוטות הרתי ומאוזנת טחולים בקבוקונים נצנוץ 20 mL או 15 מ”ל צינורות חרוט מלא עם 5 מ של Hanks´ תמיסת מלח (HBSS). המקום PDLNs 1.5 mL מ?…

Representative Results

לחקור את הביטוי של Nrp1, הליוס על תאים tTreg ו- pTreg, אנו מוכנים תאים בודדים מן בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים normoglycemic הנד עכברים, מוכתם אותם Treg תא הסמנים CD4, CD25, Foxp3, הליוס ו Nrp1 עבור זרימה cytometric ניתוח. התוצאות נותחו כפי שמוצג עם הנציג של gating אסטרטגיות (איור 1). מצאנו כי היחס ש?…

Discussion

במחקר זה, אנחנו מבודדים תאים בודדים בלוטות הרתי, PDLNs, טחולים של עכברים הנהון, חקרה את הביטוי של הליוס, Nrp1 ב CD4+CD8CD25+Foxp3+ Treg תאים באמצעות cytometry זרימה. במחקר הנוכחי, הנהון עכברים שימשו, אשר הוא מודל מאתר של סוכרת מסוג 1. במחקר הקודם, השתמשנו פראי סוג העכבר זנים CD-1 ועכברים C57B…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר הנוכחי נתמך כלכלית על ידי המועצה למחקר השבדי, EXODIAB, קרן סוכרת שוודית, קרן סוכרת ילד שבדי, סאב Diabetesfonden רוצה שתיכנס לשם ו Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. המחברים גם רוצה תודה לכל-אולה Carlsson, סטלאן סנדלר שלהם תומך ודיונים.

Materials

NOD mice In-house breading
HBSS Statens veterinärmedicinska anstalt 991750
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883-500ML
NH4Cl EMD Millipore 1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00 Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer ThermoFisher 00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience ThermoFisher 11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience ThermoFisher 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a BD Biosciences 560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody R&D Systems FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience ThermoFisher 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody BioLegend 137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap CORNING 352235 A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP Sarstedt 62.554.002
Micro tube 1.5ml Sarstedt 72.690.001
disposable scintillation vials WHEATON
Flow cytometry BD
Flow cytometry analysis software Inivai Technologies Flowlogic

References

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

Play Video

Cite This Article
Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., Singh, K. Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (144), e58848, doi:10.3791/58848 (2019).

View Video