Summary

تحديد المجموعات الفرعية التنظيمية تي الخلية في الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال باستخدام التدفق الخلوي

Published: February 27, 2019
doi:

Summary

وهنا، نقدم بروتوكول لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال إلى مواصلة دراسة هذه الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية الخلايا التائية التنظيمية باستخدام التدفق الخلوي.

Abstract

لدينا الجهاز المناعي يتكون من عدد ومتنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك الخلايا خلايا (تريغ) T التنظيمية. ويمكن تقسيم الخلايا تريغ مجموعات فرعية اثنين والغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج) والمستحثه محيطيا تريغ (بتريج) الخلايا. وهي موجودة في مختلف أجهزة الجسم ويمكن تمييزها بعلامات معينة، مثل هيليوس ونيوروبيلين 1. وأفيد أن خلايا تريج وظيفيا القمعية أكثر من الخلايا بتريج. ولذلك، من المهم تحديد نسبة خلايا تريج وبتريج عند التحقيق في الخلية غير المتجانسة السكان. وهنا، جمعنا الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس والطحال من الفئران السكري غير السمنة نورموجليسيميك لتمييز خلايا تريج من الخلايا بتريج استخدام التدفق الخلوي. قمنا بإعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة يدوياً. Fluorochrome مترافق السطحية CD4، CD8، CD25، واستخدمت الأجسام المضادة نيوروبيلين 1 وصمة عار الخلايا. وضعوا في الثلاجة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، كانت ملطخة الخلايا fluorochrome مترافق أضداد Foxp3 وهيليوس داخل الخلايا. واستخدمت هذه العلامات لوصف المجموعات اثنين من الخلايا تريغ. هذا البروتوكول يوضح طريقة بسيطة ولكنها عملية لإعداد الخلايا المفردة من الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال واستخدامها لأغراض تحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة.

Introduction

خلايا تي (تريغ) التنظيمية حاسمة بالنسبة للتوازن للجهاز المناعي. تعرف الخلايا تريغ التعبير عن المستضدات السطحية CD4 و CD25، والنسخ عامل فورخيد مربع P3 (Foxp3)1،،من23. وأظهرت ساكاجوتشى et al. أولاً أعرب CD25 هو مؤثرا في تي القامع الخلايا في الفئران4، الذي ينص مراقبة رائدة للتعرف على الخلايا البشرية تريغ. تريغ خلايا تلعب دوراً مركزياً في منأى عن التسامح بما تمارسه من قدرة قمعية عبر مجموعة متنوعة من الآليات، بما في ذلك سيتوليسيس عن طريق إفراز جرانزيميس للحث على المبرمج واستهلاك سيتوكين وتثبيط من خلال التعبير عن السامة للخلايا اللمفاويات التائية مستضد 45. بالإضافة إلى ذلك، أنها يمكن أن تفرز السيتوكينات المثبطة مثل تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، انترلوكين-10 (إيل-10)، وايل-355. يمكن بطبيعة الحال أن يستمد تريغ خلايا من الغدة الصعترية، في هذه الحالة يتم تعيينهم الغدة الصعترية المشتقة من الخلايا تريغ (تريج)، أو أنهم يمكن أن يتسبب في الأجهزة الطرفية في هذا الحالة تسمى محيطيا المستحث تريغ (بتريج) الخلايا.

هيليوس، عضو الأسرة عامل النسخ إيكاروس، أفيد بأن علامة للتمييز بين خلايا تريج والخلايا بتريج6. في وقت لاحق، أفادت مجموعتين أخريين أن مستقبل الثالث سيمافورين، نيوروبيلين 1 (Nrp1)، يمكن أن تخدم كعلامة سطحية لخلايا تريج تحت بعض الظروف7،8. ومع ذلك، أظهرت سينغ et al. أن Helios علامة أفضل في هذا السياق بالسذاجة الفئران9.

مجموعات فرعية الخلايا تريغ تلعب دوراً محوريا في الحفاظ على التوازن في الجهاز المناعي، وفي الحماية من العدوى والمناعة الذاتية. ولذلك، من المهم تحديد أرقام ونسب هؤلاء السكان في الأنسجة اللمفاوية وغير اللمفاوية على حد سواء. ولتحقيق ذلك، يتعين على المرء أن إعداد تعليق خلية واحدة فقط من هذه الأجهزة. تم وصف عدد من البروتوكولات أو المستخدمة في الدراسات السابقة. أساسا، ديسوسياتورس التلقائي قد استخدمت في التقارير المنشورة سابقا10،11. ديسوسياتورس التلقائي باستخدام مناسب وتوفير الوقت، وإنما إجراء مكلفة. ولذلك، استخدمنا أسلوب يدوي لإعداد تعليق خلية مفردة من مورين الغدة الصعترية الغدد الليمفاوية تجفيف البنكرياس (بدلنس) والطحال من الفئران (الإيماءة) السكري غير السمنة نورموجليسيميك، وعزل الخلايا المفردة من هذه الأجهزة. وقد استخدم هذا الأسلوب في دراساتنا السابقة ووجدنا أن الطريقة اليدوية لإعداد تعليق خلية مفردة بكفاءة ديسوسياتور التلقائي الأسلوب9،12،،من1314. وعلاوة على ذلك، استخدمنا التدفق الخلوي لتحديد نسب CD4+CD8CD25+Foxp3+ تريغ خلايا ومجموعات فرعية من تريغ الخلايا خلايا تريج وبتريج. تم تمييز خلايا تريج وبتريج استخدام هيليوس و Nrp1 كعلامات لخلايا تريج. وهكذا، تشير النتائج التي توصلنا إليها أن الطريقة اليدوية لإعداد الخلايا المفردة العمل بكفاءة، ويمكن استخدام تعليق خلية واحدة مستعدة كذلك لدراسات استخدام التدفق الخلوي.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات الحيوانات المحلية في جامعة أوبسالا في التجارب على الحيوانات. 1-جمع الأجهزة من الحيوانات التضحية الفئران بخلع عنق الرحم. مكان الغدد الغدة الصعترية والطحال في قنينات التﻷلؤ 20 مل أو 15 مل أنابيب مخروطية الشكل مليئة 5 مل Hanks´ متوازن الحل الملح (حب…

Representative Results

للتحقيق في التعبير عن Nrp1 وهيليوس في خلايا تريج وبتريج، إعداد الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال نورموجليسيميك إيماءة الفئران والملون منها مع علامات خلية تريغ CD4، CD25، Foxp3، هيليوس، و Nrp1 لتدفق سيتوميتريك تحليل. تم تحليل النتائج كما هو موضح في الممثل الن?…

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن عزل الخلايا المفردة من الغدد الغدة الصعترية، بدلنس والطحال من الفئران إيماءة، والتحقيق في التعبير عن هيليوس و Nrp1 في خلايا CD4+CD8CD25+Foxp3+ تريغ الخلايا باستخدام التدفق الخلوي. واستخدمت في هذه الدراسة، الفئران إيماءة، الذي هو نموذج مورين من داء الس?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذه الدراسة دعم مالي من مجلس البحوث السويدية، اكسودياب، ومؤسسة السكري السويدية والصندوق السكري الطفل السويدي، سيب ديابيتيسفوندين و O.E. أوتش ادلا جوهانسونس فيتينسكابليجا ستيفتيلسي. المؤلف يود أيضا بفضل كل علا كارلسون وساندلر ستيلان ليدعم والمناقشات.

Materials

NOD mice In-house breading
HBSS Statens veterinärmedicinska anstalt 991750
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R0883-500ML
NH4Cl EMD Millipore 1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set ThermoFisher 00-5523-00 Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer ThermoFisher 00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience ThermoFisher 11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience ThermoFisher 12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a BD Biosciences 560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody R&D Systems FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience ThermoFisher 25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody BioLegend 137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap CORNING 352235 A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15ml, 120x17mm, PP Sarstedt 62.554.002
Micro tube 1.5ml Sarstedt 72.690.001
disposable scintillation vials WHEATON
Flow cytometry BD
Flow cytometry analysis software Inivai Technologies Flowlogic

References

  1. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  2. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
  3. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  4. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  5. Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
  6. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
  7. Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
  8. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
  9. Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
  10. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
  12. Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
  13. Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
  14. Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).

Play Video

Cite This Article
Luo, Z., Thorvaldson, L., Blixt, M., Singh, K. Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (144), e58848, doi:10.3791/58848 (2019).

View Video