Analizzando per polifosfato inorganico nei batteri
Summary
Descriviamo un metodo semplice per rapida quantificazione di polifosfato inorganico in diversi batteri, tra cui specie micobatteriche, Gram-positivi e Gram-negative.
Abstract
Polifosfato inorganico (polipo) è un polimero biologico trovato in cellule da tutti i domini della vita ed è necessaria per la virulenza e la risposta allo stress in molti batteri. Ci sono una varietà di metodi per quantificare polyP nei materiali biologici, molti dei quali sono laboriosi o insensibile, limitando la loro utilità. Presentiamo qui un metodo semplificato per la quantificazione del polipo nei batteri, usando un’estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un’elaborazione rapida di più campioni, digestione del polipo con il polipo specifiche exopolyphosphatase ScPPX e rilevamento della risultante fosfato libero con un saggio colorimetrico basato su acido ascorbico sensibile. Questa procedura è semplice, poco costoso e permette la quantificazione affidabile polipo in diverse specie batteriche. Vi presentiamo la quantificazione di polipo rappresentativo dal batterio gram-negativo (Escherichia coli), il batterio gram-positivo dell’acido lattico (Lactobacillus reuteri) e la specie micobatterica (Mycobacterium smegmatis). Abbiamo anche un semplice protocollo per purificazione di affinità del nichel di quantità di mg di ScPPX, che non è attualmente disponibile in commercio.
Introduction
Polifosfato inorganico (polipo) è un biopolimero lineare delle unità di fosfato phosphoanhydride-collegato che si trova in tutti i domini di vita1,2,3. In diversi batteri, polipo è essenziale per la risposta allo stress, motilità, formazione di biofilm, controllo del ciclo cellulare, antibiotico-resistenza e virulenza4,5,6,7,8 ,9,10,11. Studi del metabolismo di polipo in batteri quindi hanno il potenziale per produrre intuizioni fondamentali la capacità dei batteri di causare malattia e prosperano in ambienti diversi. In molti casi, tuttavia, i metodi disponibili per quantificare polipo in cellule batteriche sono un fattore limitante in questi studi.
Ci sono diversi metodi attualmente utilizzati per misurare i livelli di polipo in materiali biologici. Questi metodi implicano in genere due fasi distinte: estrazione di polipo e quantificare il polipo presente in tali estratti. L’attuale metodo gold standard, sviluppato per il lievito Saccharomyces cerevisiae da Bru e colleghi12, polipo estratti insieme a DNA e RNA usando fenolo e cloroformio, seguita dalla precipitazione dell’etanolo, il trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) e ribonucleasi (RNasi) e la digestione del polyP purificato risultante con lo S. cerevisiae polipo-degradanti enzima exopolyphosphatase (ScPPX)13 a cedere gratis fosfato, che è poi quantificato utilizzando un analisi colorimetrica base verde di malachite. Questa procedura è altamente quantitativa ma alta intensità di lavoro, limitando il numero di campioni che possono essere elaborati in un singolo esperimento e non è ottimizzato per campioni batterici. Altri hanno segnalato estrazione polipo da una varietà di cellule e tessuti utilizzando perline (“glassmilk”) di silice o silice membrana colonne6,14,15,16,17, 18. Questi metodi non estrarre in modo efficiente catena corta polipo (meno di 60 unità di fosfato)12,14,15, anche se questo è di meno preoccupazione per i batteri, che sono pensati generalmente per sintetizzare principalmente Polipo della lungo-catena3. Vecchi metodi di estrazione di polipo con acidi forti19,20 non più ampiamente sono usati, poiché il polyP è instabile in condizioni acide12.
Ci sono anche una varietà di metodi segnalati per quantificare il polyP. Tra i più comuni è 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), una tintura fluorescente più tipicamente usata per macchiare il DNA. Complessi di DAPI-polipo hanno maxima di eccitazione e di emissione di fluorescenza diversi oltre DAPI-DNA complessi21,22, ma c’è una notevole interferenza da altri componenti cellulari, tra cui RNA, nucleotidi e inositolo fosfati12,15,16,23, riducendo la specificità e la sensibilità delle misurazioni di polipo effettuate utilizzando questo metodo. In alternativa, il polipo e adenosina difosfato (ADP) può essere convertiti in adenosina trifosfato (ATP) usando purificato Escherichia coli chinasi polipo (PPK) e l’ATP risultante quantificati tramite luciferasi14,17 ,18. Questo permette la rilevazione di piccole quantità di polipo, ma richiede due fasi di reazione enzimatica e luciferina e ADP molto puro, che sono i reagenti costosi. In particolare il digest polipo in fosfato libero6,12,13,24, che può essere rilevato utilizzando metodi più semplici, ma ScPPX è inibita da DNA e RNA12, ScPPX trattamento della dnasi e RNasi che necessita di polipo-contenenti estratti. PPK, né ScPPX sono disponibili in commercio, e purificazione di PPK è relativamente complesso25,26.
Polipo in lisati cellulari o estratti possa anche essere visualizzato su gel di poliacrilammide di DAPI27,28,29,30, un metodo che permette la valutazione della lunghezza della catena, ma è la macchiatura negativa scarsamente quantitativa e bassa velocità.
Ora segnaliamo un saggio di polipo veloce, poco costoso, media-velocità di trasmissione che permette la rapida quantificazione del polyP livelli in diverse specie batteriche. Questo metodo inizia con la lisi delle cellule batteriche a 95 ° C in 4m guanidina isotiocianato (GITC)14 per inattivare cellulare fosfatasi, seguite da un’estrazione della colonna membrana silice ottimizzata per un’elaborazione rapida di campioni multipli. Il polipo-contenere l’Estratto risultante viene poi digerito con un grande eccesso di ScPPX, eliminando la necessità per il trattamento della dnasi e RNasi. Includiamo un protocollo per la purificazione di affinità nichel semplice di quantità di mg di ScPPX. Infine, fosfato libero polipo-derivato è quantificato con un saggio colorimetrico semplice, sensibile, basati su acido ascorbico24 e normalizzato a proteine cellulari totali. Questo metodo semplifica la misurazione del polipo in cellule batteriche, e dimostriamo l’utilizzo con specie rappresentative di batteri gram-negativi, batteri Gram-positivi e micobatteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui semplifica e accelera la quantificazione dei livelli di polipo in diversi batteri, con un tipico insieme di 24 campioni prendendo circa 1,5 h per elaborare completamente. Questo permette di screening rapido di campioni e analisi di librerie mutante e semplifica il esperimenti cinetici misura l’accumulo di polipo nel corso del tempo. Abbiamo dimostrato che il protocollo funziona in modo efficace sui rappresentanti di tre diversi phyla: proteobacteria, firmicutes e actinobacteria, che sono noti …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto era sostenuto dalla University of Alabama a Birmingham dipartimento di microbiologia avvio fondi e sovvenzioni NIH R35GM124590 (per MJG) e NIH sovvenzione R01AI121364 (FW).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
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