Summary

Dosage de Polyphosphate inorganique chez les bactéries

Published: January 21, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode simple pour la quantification rapide de polyphosphate inorganique dans diverses bactéries, y compris les espèces Gram négatifs, bactéries gram-positives et mycobactériennes.

Abstract

Polyphosphate inorganique (polype) est un polymère biologique dans les cellules de tous les domaines de la vie et est exigé pour la virulence et la réponse au stress chez les nombreuses bactéries. Il existe une variété de méthodes de quantification polype en biomatériaux, dont beaucoup sont fastidieuses ou insensible, limitant leur utilité. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la quantification des polypes chez les bactéries, en utilisant une extraction de colonne silice membrane optimisée pour un traitement rapide de plusieurs échantillons, digestion du polype avec le polype spécifiques exopolyphosphatase ScPPX et la détection de la phosphate de libre qui en résulte avec un dosage colorimétrique sensible-à base d’acide ascorbique. Cette procédure est simple, peu coûteux et permet la quantification fiable polype dans diverses espèces de bactéries. Nous présentons la quantification de polype représentatifs de la bactérie à gram négatif (Escherichia coli), la bactérie Gram-positive lactiques (Lactobacillus reuteri) et les espèces de mycobactéries (Mycobacterium smegmatis). Nous incluons également un protocole simple pour la purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX, qui n’est pas actuellement disponible dans le commerce.

Introduction

Polyphosphate inorganique (polype) est un biopolymère linéaire d’unités de phosphate lié à phosphoanhydride que l’on retrouve dans tous les domaines de la vie1,2,3. Diverses bactéries, polype est essentiel pour la réponse au stress, motilité, la formation de biofilm, contrôle du cycle cellulaire, la résistance aux antibiotique et virulence4,5,6,7,8 ,9,10,11. Études du polype métabolisme chez les bactéries ont donc la possibilité de déboucher sur des connaissances fondamentales sur la capacité des bactéries causent la maladie et se développent dans divers environnements. Dans de nombreux cas, toutefois, les méthodes permettant de quantifier polype dans les cellules bactériennes sont un facteur limitant dans ces études.

Il y a plusieurs méthodes actuellement utilisées pour mesurer les niveaux de polype en matières biologiques. Ces méthodes impliquent généralement deux étapes distinctes : extraction de polype et quantifier le polype présent dans ces extraits. La méthode actuelle de l’étalon-or, développé pour la levure Saccharomyces cerevisiae par Bru et ses collègues12, polype extraits ainsi que l’ADN et l’ARN à l’aide de phénol et de chloroforme, suivie par précipitation à l’éthanol, le traitement par désoxyribonucléase (DNase) et ribonucléase (RNase) et la digestion du polype purifiée obtenue avec le S. cerevisiae dégradant le polype enzyme exopolyphosphatase (ScPPX)13 à céder gratuitement phosphate, qui est ensuite quantifié à l’aide une Malachite verte essai reposant sur la colorimétrie. Cette procédure est très quantitative, mais fastidieux, limitant le nombre d’échantillons qui peuvent être traitées dans une expérience simple, n’est pas optimisé pour les échantillons bactériens. D’autres ont rapporté extraction polype d’une variété de cellules et de tissus à l’aide de perles de silice (« glassmilk ») ou silice membrane colonnes6,14,15,16,17, 18. Ces méthodes ne retirer pas efficacement à chaîne courte polype (moins de 60 unités de phosphate)12,14,15, bien que cela soit moins préoccupante pour les bactéries, qui sont généralement réputés pour synthétiser principalement polype de longue chaîne3. Anciennes méthodes d’extraction de polype à l’aide d’acides forts19,20 sont n’est plus largement utilisés, étant donné que le polype est instable sous conditions acides12.

Il existe également une variété de méthodes déclarées pour quantifier polype. Parmi les plus courantes est 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent plus généralement utilisé pour colorer les ADN. DAPI-polype complexes ont des maxima d’excitation et d’émission de fluorescence différente que DAPI-ADN complexes21,22, mais il y a beaucoup d’autres composants cellulaires, y compris les ARN, nucléotides et inositol phosphates12,15,16,23, réduisant la spécificité et la sensibilité des mesures de polype effectuées à l’aide de cette méthode. Alternativement, les polypes et adénosine diphosphate (ADP) peuvent être convertis en adénosine triphosphate (ATP) à l’aide de purifiée Escherichia coli kinase polype (PPK) et l’ATP qui en résulte, quantifiée à l’aide de la luciférase14,17 ,,18. Cela permet la détection de très petites quantités de polype, mais nécessite deux étapes de la réaction enzymatique et luciférine et ADP très pure, qui sont des réactifs coûteux. ScPPX spécifiquement digestions polype en phosphate libre6,12,13,24, qui peut être détectée par des méthodes plus simples, mais ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN12, nécessitant un traitement DNase et RNase polype contenant des extraits. PPK ni ScPPX sont disponibles dans le commerce, et purification de PPK est relativement complexe25,26.

Polype dans les lysats cellulaires ou des extraits aussi peut être visualisée sur gel de polyacrylamide par DAPI27,28,29,30, une méthode qui permet l’évaluation de la longueur de la chaîne, mais est une coloration négatif bas-débit et mal quantitative.

Nous rapportons un dosage de polype moyen débit, peu coûteux et rapide qui permet la quantification rapide de polype niveaux chez diverses espèces bactériennes. Cette méthode commence par la lyse des cellules bactériennes à 95 ° C en 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 pour inactiver des phosphatases cellulaires, suivies d’une extraction de colonne silice membrane optimisée pour le traitement rapide des échantillons multiples. L’extrait contenant du polype qui en résulte est ensuite digéré avec un grand excès de ScPPX, éliminant le besoin de traitement DNase et RNase. Nous incluons un protocole pour simple purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX. Enfin, phosphate libre dérivé de polype est quantifié avec un dosage colorimétrique simple, sensible, à base d’acide ascorbique24 et normalisée à total des protéines cellulaires. Cette méthode simplifie la mesure de polype dans des cellules bactériennes, et nous montrer son utilisation avec des espèces représentatives des bactéries à gram négatif, bactéries gram-positives et mycobactéries.

Protocol

1. purification de levure Exopolyphosphatase (ScPPX) Transformer la souche de la surexpression de protéines Escherichia coli BL21 (de3)31 avec le plasmide pScPPX26 par électroporation32 ou33de la transformation chimique. Ensemencer 1 L de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µg, ampicilline des-1 mL dans une fiole débafflé 2 L avec une seule colonie de BL21 (de3) contenant pScP…

Representative Results

Les étapes clés du protocole sont schématisés sous une forme simplifiée de la Figure 1. Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-négatives, sauvage, e. coli MG165539 a été passé à la phase logarithmique en milieu riche LB à 37 ° C sous agitation (200 tr/min), puis rincé et incubées pendant 2 h supplémentaires dans morphol…

Discussion

Le protocole décrit ici simplifie et accélère la quantification des niveaux de polype dans diverses bactéries, avec un ensemble typique de 24 échantillons prenant environ 1,5 h à traiter entièrement. Cela permet le dépistage rapide des échantillons et l’analyse des bibliothèques mutantes et simplifie les expériences cinétiques mesurant l’accumulation de polype au fil du temps. Nous avons démontré que le protocole fonctionne efficacement sur les représentants de trois différents phyla : proteobacteria…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été soutenu par l’Université de l’Alabama au fonds de démarrage de Birmingham département de microbiologie et NIH grant R35GM124590 (à MJG) et NIH subvention R01AI121364 (FW).

Materials

E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

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Cite This Article
Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

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