Assaying עבור הפוליפוספאט אורגניים של חיידקים
Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה על כימות מהירה של אי-אורגנית הפוליפוספאט בחיידקים מגוונים, כולל זנים גראם שליליים, גראם חיובי ו- mycobacterial.
Abstract
הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא פולימר הביולוגי נמצאו תאים בכל תחומי החיים, והוא נדרש עבור התקפה אלימה ותגובת דחק בחיידקים רבים. ישנם מגוון רחב של שיטות לכימות פוליפ בחומרים ביולוגיים, שרבים מהם הם עתירי עבודה או רגישות, הגבלת התועלת שלהם. אנו מציגים כאן שיטה יעילה על פוליפ כימות של חיידקים, באמצעות סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של מספר דגימות, העיכול של פוליפ עם exopolyphosphatase ספציפיים פוליפ ScPPX זיהוי של פוספט חינם שנוצר עם רגיש מבוססי חומצה אסקורבית ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. הליך זה היא פשוטה, זולה, מאפשרת כימות פוליפ אמין מגוונת מיני החיידקים. אנו מציגים כימות פוליפ מייצג חיידק גראם שליליים (Escherichia coli), חיידק גראם חיוביים חומצה לקטית (לקטובצילוס reuteri), המין mycobacterial (Mycobacterium smegmatis). אנו כוללים גם פרוטוקול פשוט לטיהור זיקה ניקל של כמויות מ ג של ScPPX, אשר אינה כיום זמינים מסחרית.
Introduction
הפוליפוספאט אי-אורגנית (פוליפ) הוא ביופולימרים ליניארי של יחידות מקושרים phosphoanhydride פוספט המצויה בכל תחומי החיים-1,–2,–3. בחיידקים מגוונים, פוליפ הוא חיוני תגובת המתח, תנועתיות, ביופילמים, בקרה מחזור התא, עמידות לאנטיביוטיקה של התקפה אלימה4,5,6,7,8 ,9,10,11. מחקרים של פוליפ מטבוליזם של חיידקים לכן יש את הפוטנציאל להניב תובנות יסוד היכולת של החיידקים לגרום למחלות ולשגשג בסביבות מגוונות. עם זאת, במקרים רבים, השיטות הזמינות עבור לכימות פוליפ בתאי חיידקים הם גורם מגביל במחקרים אלה.
ישנן מספר שיטות בשימוש כיום כדי למדוד רמות פוליפ חומרים ביולוגיים. שיטות אלה כוללות בדרך כלל שני שלבים נפרדים: חילוץ פוליפ וכימות הפוליפ נוכח תמציות אלה. השיטה הנוכחית תקן הזהב, שפותחה עבור שמרים האפייה -ברו ועמיתיו12, תמציות פוליפ יחד עם ה-DNA ו- RNA באמצעות פנול, כלורופורם, ואחריו אתנול משקעים, טיפול עם deoxyribonuclease (DNase) ribonuclease (RNase), ואת מערכת העיכול של הפוליפ מטוהרים שנוצר עם cerevisiae ס משפיל-פוליפ אנזים exopolyphosphatase (ScPPX)13 תשואות פוספט חינם, אשר הוא אז לכמת באמצעות מלכיט מבוסס-ירוק ערכי צבע מוחלטים וזמינותו. ההליך זה מאוד כמותית אך עתירי עבודה, הגבלת מספר דוגמאות ניתן יהיה לעבד ניסוי יחיד, והוא אינו ממוטב עבור דגימות בקטריאליות. אחרים דיווחו על חילוץ פוליפ ממגוון רחב של תאים ורקמות חרוזים סיליקה (“glassmilk”) או סיליקה ממברנה עמודות6,14,15,16,17, 18. שיטות אלה לא ביעילות לחלץ קצרות שרשרת פוליפ (פחות מ 60 יחידות פוספט)12,14,15, זה אמנם פחות לדאגה עבור חיידקים, אשר נחשבים בדרך כלל לסנתז בעיקר פוליפ ארוכי שרשרת3. שיטות בוגרים של פוליפ חילוץ באמצעות חומצות חזקות19,20 נמצאים בשימוש נרחב יותר, מאז פוליפ יציב תחת תנאים חומציים12.
יש גם מגוון רחב של שיטות דיווח פוליפ לכימות. בין הנפוצה ביותר היא 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), הפלורסנט יותר לרוב נעשה שימוש כדי להכתים את הדנ א. דאפי-פוליפ מתחמי maxima עירור, פליטת קרינה פלואורסצנטית שונה מאשר דאפי-DNA מתחמי21,22, אבל יש הפרעה ניכרת של רכיבים אחרים התאית, כולל ה-RNA, נוקלאוטידים ואינוזיטול פוספטים12,15,16,23, הפחתת רגישות של פוליפ מדידות שנעשו באמצעות שיטה זו של ירידה לפרטים. לחלופין, פוליפ, אדנוזין diphosphate (ADP) יכולים להיות מומרים אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות מטוהרים Escherichia coli פוליפ קינאז (ממ ק), וכתוצאה מכך מ- ATP לכמת באמצעות לוציפראז14,17 ,18. זה מאפשר הגילוי של כמויות קטנות מאוד של פוליפ, אך דורש שני צעדים התגובה אנזימטיות, luciferin והן ADP טהור, אשר ריאגנטים יקר. ScPPX במיוחד מעכל פוליפ לתוך פוספט חינם6,12,13,24, אשר ניתן לאתרם באמצעות שיטות פשוטות יותר, אבל ScPPX מעוכבת על ידי DNA ו- RNA12, המחייב DNase RNase וטיפול של פוליפ המכילים תמציות. ממ ק וגם ScPPX הם זמינים מסחרית, טיהור ממ ק מורכבות יחסית25,26.
פוליפ תא lysates או תמציות גם להיות visualized על ג’לים לזיהוי מאת דאפי שלילי מכתים27,28,29,30, שיטה לאפשר הערכה של אורך שרשרת, אך תפוקה נמוכה, לקוי כמותית.
כעת מדווחים על assay פוליפ מהיר, זול, תפוקה בינונית המאפשר כימות מהירה של פוליפ רמות מגוונת מיני החיידקים. שיטה זו מתחיל lysing תאים חיידקיים ב 95 ° C 4 מ- guanidine-isothiocyanate (GITC)-14 כדי להשבית phosphatases הסלולר, ואחריו סיליקה ממברנה טור החילוץ אופטימיזציה עבור עיבוד מהיר של דגימות מרובים. התמצית המתקבלת המכילות פוליפ מתעכלת ואז עם עודף גדול של ScPPX, ביטול הצורך DNase וטיפול RNase. אנו כוללים פרוטוקול לטיהור זיקה ניקל פשוטה של כמויות מ ג של ScPPX. לבסוף, פוליפ-derived פוספט חינם לכמתו פשוט, רגיש, המבוסס על חומצה אסקורבית assay ערכי צבע מוחלטים24 , מנורמל לחלבון סלולרי הכולל. שיטה זו מייעלת את המדידה של פוליפ תאים חיידקיים, נדגים את השימוש עם נציג מינים של חיידקים גראם שליליים, חיידקים גראם חיוביים mycobacteria.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מפשט ומאיץ כימות של פוליפ רמות חיידקים מגוונות, עם ערכה טיפוסית של דגימות 24 לוקח בערך 1.5 h לעבד באופן מלא. זה מאפשר מיון מהיר של דגימות וניתוח של ספריות מוטציה, מפשט את הניסויים קינטי מדידה ההצטברות של פוליפ לאורך זמן. הראו כי הפרוטוקול פועלת ביעילות על נציגי שלוש phyla שונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה נתמך על ידי אוניברסיטת אלבמה-קרנות אתחול המחלקה למיקרוביולוגיה של ברמינגהאם NIH מענק R35GM124590 (MJG) ואת NIH מענק R01AI121364 (FW).
Materials
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate–an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate–new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
