Summary

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

Published: June 22, 2019
doi:

Summary

Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.

Abstract

Para simular la infección por Cryptococcus, la ameba, que es el depredador natural de las células criptocócicas en el entorno, se puede utilizar como modelo para macrófagos. Este organismo depredador, similar a los macrófagos, emplea fagocitosis para matar las células internalizadas. Con la ayuda de un microscopio de exploración láser confocal, se capturan imágenes que representan momentos interactivos entre las células criptocócicas y la ameba. La potencia de resolución del microscopio electrónico también ayuda a revelar el detalle ultraestructural de las células criptocócicas cuando están atrapadas dentro de la vacuola de alimentos de la ameba. Dado que la fagocitosis es un proceso continuo, los datos cuantitativos se integran en el análisis para explicar lo que sucede en el momento en que se captura una imagen. Para ser específicos, se leen unidades de fluorescencia relativa para cuantificar la eficiencia de la ameba en la internalización de las células criptocócicas. Para este propósito, las células criptocócicas se tiñen con un tinte que las hace fluorescencia una vez atrapadas dentro del ambiente ácido de la vacuola alimentaria. Cuando se utiliza en conjunto, la información recopilada a través de estas técnicas puede proporcionar información crítica para ayudar a sacar conclusiones sobre el comportamiento y el destino de las células cuando se internalizan por la ameba y, posiblemente, por otras células fagocíticas.

Introduction

Los microbios han evolucionado con el tiempo para ocupar y prosperar en diferentes nichos ecológicos como los límites físicos abiertos del suelo y el agua, entre otros1. En estos nichos, los microbios a menudo participan en la competencia directa por recursos limitados; importante, para los nutrientes que utilizan para apoyar su crecimiento o espacio,que necesitan para acomodar a la población en expansión 2,3. En ciertos casos, algunos organismos holozoicos como la ameba pueden incluso ser anteriores a las células criptocócicas como una forma de extraer nutrientes de su biomasa4,5. A su vez, esto permite a estos organismos establecer el dominio territorial mediante el control del número de población de su presa. Debido a esta presión depredadora, algunas presas pueden ser seleccionadas para producirfactores microbianos, como la cápsula criptocócica 6, para conciliar los efectos negativos de la presión. Sin embargo, como consecuencia involuntaria de esta presión, algunos microbios adquieren factores que lespermiten cruzar la barrera de las especies y buscar nuevos nichos para colonizar 7, como los espacios confinados del cuerpo humano que son ricos en nutrientes y tienen ideal Condiciones. Este último puede explicar cómo un microbio terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pueden transformarse para convertirse en patógenos.

Con este fin, es importante estudiar el contacto inicial que las células criptocócicas pueden tener con la ameba y cómo esto puede seleccionarlas para convertirse en patógenas. Más específicamente, Esto puede dar pistas sobre cómo se comportan las células criptocócicas cuando se actúa sobre los macrófagos durante la infección. Es por esta razón que la ameba fue elegida como modelo para macrófagos aquí, ya que es relativamente barato y fácil de mantener un cultivo de ameba en un laboratorio8. De interés era también examinar cómo los metabolitos secundarios criptococcales viz. 3-hidroxi ácidos grasos9,10 influyen en la interacción entre las amebas y las células criptocócicas.

Una forma sencilla de percibir la interacción entre la ameba y su presa a simple vista es crear un césped usando su presa en la superficie de una placa de agar y ameba plana. La visualización de placas o zonas claras en la placa de agar representa áreas donde la ameba puede haberse alimentado de su presa. Sin embargo, a este nivel macro, sólo se observa el resultado del proceso, y el proceso de fagocitosis se mecaniza no se puede observar. Por lo tanto, para apreciar el proceso de célula a célula, hay varios métodos microscópicos que se pueden utilizar11,12. Por ejemplo, un microscopio invertido con una cámara de incubación se puede utilizar para grabar en vídeo un lapso de tiempo de eventos entre una célula fagocítica y su objetivo13. Desafortunadamente, debido al costo de un microscopio con una funcionalidad de lapso de tiempo, no siempre es posible que los laboratorios compren un microscopio de este tipo, especialmente en entornos de recursos deficientes.

Para eludir la limitación anterior, este estudio presenta un diseño exploratorio secuencial que evalúa la interacción de C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 y C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . En primer lugar, se utiliza un método cualitativo que precede a un método cuantitativo. Las imágenes fijas se capturan utilizando un microscopio de fluorescencia invertida, así como un microscopio electrónico de transmisión para representar interacciones de ameba-Cryptococcus. Esto fue seguido por la cuantificación de la fluorescencia utilizando un lector de placas para estimar la eficiencia de la ameba para internalizar las células criptocócicas. Al conciliar los hallazgos de estos métodos durante la etapa de interpretación de datos, esto puede revelar tanta información crítica como la de la aplicación de un vídeo de lapso de tiempo de fagocitosis.

Protocol

Cryptococcus neoformans y algunas cepas de Acanthamoeba castellanii se consideran patógenos de nivel 2 de bioseguridad (BSL-2); por lo tanto, los investigadores deben tomar las precauciones adecuadas al trabajar con estos organismos. Por ejemplo, el personal de laboratorio debe tener capacitación específica y equipo de protección personal (EPP) como abrigos de laboratorio, guantes y protección ocular. Se debe utilizar un armario de seguridad biológico (nivel 2) para procedimientos que puedan causa…

Representative Results

Los microbios son organismos microscópicos que no se pueden percibir a simple vista. Sin embargo, su impacto puede resultar en enfermedades observables clínicamente evidentes, como infecciones de la piel. Al estudiar ciertos aspectos de los microbios, que van desde su morfología, subproductos e interacciones, ser capaz de proporcionar evidencia pictórica y de vídeo es de suma importancia. Primero buscamos visualizar la inte…

Discussion

En el documento, se emplearon con éxito diferentes técnicas para revelar el posible resultado que puede surgir cuando la ameba interactúa con las células criptocócicas. También, estábamos interesados en mostrar los efectos de los ácidos grasos 3-hidroxi en el resultado de las interacciones Cryptococcus-amoeba.

La primera técnica utilizada fue la microscopía confocal, que representaba imágenes fijas. El principal inconveniente de esta técnica aquí fue que sólo nos dio inf…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica (número de subvención: UID 87903) y la Universidad del Estado Libre. También estamos agradecidos con los servicios y la asistencia ofrecidos por Pieter van Wyk y Hanlie Grobler durante nuestros estudios de microscopía.

Materials

1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane Sigma-Aldrich D27802
1.5-mL plastic tube  Thermo Fisher Scientific 69715
15-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 7252018
50-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 1132017
8-Well chamber slide Thermo Fisher Scientific 1109650
Acetone Merck SAAR1022040LC
Amoeba strain ATCCÒ 30234TM
ATCC medium 712 ATCCÒ 712TM Amoeba medium
Black 96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 152089
Centrifuge Hermle
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Confocal microscope Nikon Nikon TE 2000
Epoxy resin:
[1] NSA [1] ALS [1] R1054
[2] DER 736 [2] ALS [2] R1073
[3] ERL Y221 resin [3] ALS [3] R1047R
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol) [4] ALS  [4] R1067
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F4274
Formic Acid Sigma-Aldrich 489441
Fluoroskan Ascent FL Thermo Fisher Scientific 374-91038C Microplate reader
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glutaraldehyde ALS R1009
Hemocytometer Boeco
Lead citrate ALS R1209
Liquid Chromatography Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Methanol Sigma-Aldrich R 34,860
Orbital shaker Lasec 
Osmium tetroxide ALS R1015
pHrodo Green Zymosan A BioParticles Life Technologies P35365 This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solution Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Rotary shaker Labcon
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate  [1] Merck [1] 106580
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate [2] Merck  [2] 106345
Transmission electron microscope Philips Philips EM 100 
Trypan blue  Sigma-Aldrich T8154
Ultramicrotome Leica EM UC7
Uranyl acetate ALS R1260A
Vacuum dessicator Lasec 
Vial Sigma-Aldrich 29651-U
YNB Lasec  239210
YPD agar Sigma-Aldrich Y-1500

References

  1. Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
  4. Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
  5. Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
  7. Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
  8. Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
  9. Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
  10. Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
  11. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
  12. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
  13. Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
  14. Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
  15. Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
  16. Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
  17. Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
  19. Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  20. Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
  21. Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  22. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
  23. van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
  24. Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
  25. Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
  26. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
  27. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  28. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
  29. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
  30. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
  31. Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
  32. Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
  33. Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).

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Cite This Article
Madu, U. L., Sebolai, O. M. Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions. J. Vis. Exp. (148), e58698, doi:10.3791/58698 (2019).

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