Summary

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

Published: June 22, 2019
doi:

Summary

Dieses Papier beschreibt ein Protokoll zur Vorbereitung einer Kokultur von Kryptokokkenzellen und Amöben, die mit Standbildern, fluoreszierenden Bildern und hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopbildern untersucht wird. Hier wird veranschaulicht, wie quantitative Daten solche qualitativen Informationen ergänzen können.

Abstract

Um eine Cryptococcus-Infektion zu simulieren, kann Amöbe, das natürliche Raubtier von Kryptokokkenzellen in der Umgebung, als Modell für Makrophagen verwendet werden. Dieser räuberische Organismus, ähnlich wie Makrophagen, verwendet Phagozytose, um verinnerlichte Zellen abzutöten. Mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops werden Bilder erfasst, die interaktive Momente zwischen Kryptokokkenzellen und Amöben darstellen. Die Auflösungskraft des Elektronenmikroskops hilft auch, die ultrastrukturellen Details von Kryptokokkenzellen zu enthüllen, wenn sie im Amöben-Lebensmittelvakuum gefangen sind. Da Phagozytose ein kontinuierlicher Prozess ist, werden quantitative Daten in die Analyse integriert, um zu erklären, was zum Zeitpunkt der Erfassung eines Bildes geschieht. Um genau zu sein, werden relative Fluoreszenzeinheiten gelesen, um die Effizienz von Amöben bei der Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu quantifizieren. Zu diesem Zweck werden Kryptokokkenzellen mit einem Farbstoff gefärbt, der sie fluoreszieren lässt, sobald sie in der sauren Umgebung des Nahrungsvakuums gefangen sind. Wenn sie zusammen verwendet werden, können Informationen, die durch solche Techniken gesammelt werden, wichtige Informationen liefern, um Schlussfolgerungen über das Verhalten und das Schicksal von Zellen zu ziehen, wenn sie durch Amöben und möglicherweise durch andere phagozytische Zellen verinnerlicht werden.

Introduction

Mikroben haben sich im Laufe der Zeit entwickelt, um in verschiedenen ökologischen Nischen wie den offenen physikalischen Grenzen des Bodens und des Wassers, unter anderem1, zu besetzen und zu gedeihen. In diesen Nischen liefern sich Mikroben häufig den direkten Wettbewerb um begrenzte Ressourcen; wichtig für Nährstoffe, die sie zur Unterstützung ihres Wachstums oder Raumes verwenden, die sie benötigen, um die wachsende Bevölkerung unterzubringen2,3. In bestimmten Fällen, einige holozoische Organismen wie Amöben können sogar auf Kryptokokken-Zellen als eine Möglichkeit, Nährstoffe aus ihrer Biomasse zu extrahieren4,5. Dies wiederum ermöglicht es solchen Organismen, eine territoriale Dominanz zu etablieren, indem sie die Populationszahlen ihrer Beute kontrollieren. Aufgrund dieses räuberischen Drucks können einige Beutetiere ausgewählt werden, um mikrobielle Faktoren zu erzeugen, wie die Kryptokokkenkapsel6, um die negativen Auswirkungen des Drucks in Einklang zu bringen. Als unbeabsichtigte Folge dieses Drucks erwerben einige Mikroben jedoch Faktoren, die es ihnen ermöglichen, die Artenbarriere zu überqueren und neue Nischen zu suchen, um7zu besiedeln, wie die engen Räume des menschlichen Körpers, die reich an Nährstoffen sind und ideale Bedingungen. Letzteres könnte erklären, wie eine terrestrische Mikrobe wie Cryptococcus (C.) Neoformane können sich transformieren, um pathogen zu werden.

Zu diesem Zweck ist es wichtig, den anfänglichen Kontakt zu untersuchen, den Kryptokokkenzellen mit Amöben haben können und wie diese sie auswählen können, um pathogen zu werden. Genauer gesagt, Dies kann Hinweise darauf geben, wie kryptokokken Zellen verhalten, wenn durch Makrophagen während der Infektion gehandelt. Aus diesem Grund wurde Amöbe hier als Modell für Makrophagen gewählt, da es relativ billig und einfach ist, eine Amöbenkultur in einem Labor zu pflegen8. Von Interesse war auch zu untersuchen, wie kryptokokkalsekundäre Metaboliten viz. 3-Hydroxy-Fettsäuren9,10 beeinflussen die Interaktion zwischen Amöben und Kryptokokkenzellen.

Eine einfache Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Amöben und seiner Beute mit bloßem Auge zu erkennen, besteht darin, einen Rasen mit seiner Beute auf der Oberfläche einer Agarplatte zu schaffen und Amöben zu erkennen. Die Visualisierung von Plaques oder klaren Zonen auf der Agarplatte zeigt Bereiche, in denen Amöben sich von ihrer Beute ernährt haben könnten. Auf dieser Makroebene wird jedoch nur das Ergebnis des Prozesses festgestellt, und der Prozess der Phagozytose ist mechanisiert, kann nicht beobachtet werden. Daher, um den Prozess auf zell-zu-Zell-Basis zu schätzen, gibt es mehrere mikroskopische Methoden, die verwendet werden können11,12. Beispielsweise kann ein invertiertes Mikroskop mit einer Inkubationskammer verwendet werden, um einen Zeitraffer von Ereignissen zwischen einer phagozytischen Zelle und ihrem Ziel13aufzuzeichnen. Leider ist es aufgrund der Kosten für ein Mikroskop mit Einer Zeitrafferfunktionalität nicht immer möglich, dass Laboratorien ein solches Mikroskop kaufen, insbesondere bei Ressourcenmangel.

Um die obige Einschränkung zu umgehen, präsentiert diese Studie ein sequenzielles Explorativdesign, das die Wechselwirkung von C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 und C. neoformans LMPE 046 mit Acanthamoeba castellani bewertet. . Zunächst wird eine qualitative Methode verwendet, die einer quantitativen Methode vorausgeht. Standbilder werden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop sowie einem Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen, um Amöben-Kryptokokken-Wechselwirkungen darzustellen. Es folgte die Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe eines Plattenlesers, um die Effizienz von Amöben zur Internalisierung von Kryptokokkenzellen zu schätzen. Wenn man die Ergebnisse dieser Methoden während der Dateninterpretationsphase abgleicht, kann dies ebenso viele kritische Informationen offenbaren wie das Durchlesen eines Phagozytose-Zeitraffervideos.

Protocol

Cryptococcus neoformans und einige Acanthamoeba castellanii Stämme gelten als Biosicherheits-Level-2 (BSL-2) Krankheitserreger; Daher müssen die Forscher bei der Arbeit mit diesen Organismen angemessene Vorsichtsmaßnahmen treffen. Beispielsweise sollte das Laborpersonal über spezielle Schulungen und persönliche Schutzausrüstungen (PSA) wie Labormäntel, Handschuhe und Augenschutz verfügen. Ein biologischer Sicherheitsschrank (Stufe-2) sollte für Verfahren verwendet werden, die eine Infektion ver…

Representative Results

Mikroben sind mikroskopische Organismen, die nicht mit bloßem Auge wahrgenommen werden können. Ihre Auswirkungen können jedoch zu beobachtbaren klinisch offensichtlichen Krankheiten wie Hautinfektionen führen. Bei der Untersuchung bestimmter Aspekte von Mikroben, die von ihrer Morphologie, Nebenprodukten und Wechselwirkungen reichen, ist es von größter Bedeutung, Bild- und Videobeweise liefern zu können. Wir versuchten zu…

Discussion

In dem Papier wurden verschiedene Techniken erfolgreich eingesetzt, um das mögliche Ergebnis zu enthüllen, das entstehen kann, wenn Amöben mit Kryptokokkenzellen interagieren. Außerdem waren wir daran interessiert, die Auswirkungen von 3-Hydroxy-Fettsäuren auf das Ergebnis von Cryptococcus-Amöben-Wechselwirkungen zu zeigen.

Die erste verwendete Technik war die konfokale Mikroskopie, die Standbilder wiedergab. Der hauptnachteil dieser Technik hier war, dass sie uns nur Informati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Unterstützt wurde die Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of South Africa (Fördernummer: UID 87903) und der Universität des Freistaats. Wir sind auch dankbar für die Dienstleistungen und die Unterstützung, die Pieter van Wyk und Hanlie Grobler während unserer Mikroskopiestudien angeboten haben.

Materials

1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane Sigma-Aldrich D27802
1.5-mL plastic tube  Thermo Fisher Scientific 69715
15-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 7252018
50-mL Centrifuge tube  Thermo Fisher Scientific 1132017
8-Well chamber slide Thermo Fisher Scientific 1109650
Acetone Merck SAAR1022040LC
Amoeba strain ATCCÒ 30234TM
ATCC medium 712 ATCCÒ 712TM Amoeba medium
Black 96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 152089
Centrifuge Hermle
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Confocal microscope Nikon Nikon TE 2000
Epoxy resin:
[1] NSA [1] ALS [1] R1054
[2] DER 736 [2] ALS [2] R1073
[3] ERL Y221 resin [3] ALS [3] R1047R
[4] S1 (2-dimethylaminoethanol) [4] ALS  [4] R1067
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F4274
Formic Acid Sigma-Aldrich 489441
Fluoroskan Ascent FL Thermo Fisher Scientific 374-91038C Microplate reader
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glutaraldehyde ALS R1009
Hemocytometer Boeco
Lead citrate ALS R1209
Liquid Chromatography Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Methanol Sigma-Aldrich R 34,860
Orbital shaker Lasec 
Osmium tetroxide ALS R1015
pHrodo Green Zymosan A BioParticles Life Technologies P35365 This is the pH-sensitive dye
Physiological buffer solution Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Rotary shaker Labcon
Sodium phosphate buffer:
[1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate  [1] Merck [1] 106580
[2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate [2] Merck  [2] 106345
Transmission electron microscope Philips Philips EM 100 
Trypan blue  Sigma-Aldrich T8154
Ultramicrotome Leica EM UC7
Uranyl acetate ALS R1260A
Vacuum dessicator Lasec 
Vial Sigma-Aldrich 29651-U
YNB Lasec  239210
YPD agar Sigma-Aldrich Y-1500

References

  1. Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
  2. Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
  3. Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
  4. Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
  5. Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
  6. Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
  7. Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
  8. Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
  9. Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
  10. Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
  11. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
  12. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
  13. Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
  14. Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
  15. Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
  16. Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
  17. Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
  19. Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
  20. Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
  21. Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
  22. Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
  23. van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
  24. Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
  25. Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
  26. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
  27. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
  28. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
  29. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
  30. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
  31. Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
  32. Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
  33. Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).

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Cite This Article
Madu, U. L., Sebolai, O. M. Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions. J. Vis. Exp. (148), e58698, doi:10.3791/58698 (2019).

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