Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações
Summary
Este papel detalha um protocolo para preparar uma cocultura de pilhas e de amebas criptocócica que é estudado usando imagens imóveis, fluorescentes e imagens de alta resolução do microscópio de elétron da transmissão. Ilustrados aqui é como os dados quantitativos podem complementar tais informações qualitativas.
Abstract
Para simular a infecção por Cryptococcus , a ameba, que é o predador natural das células criptocócicas no ambiente, pode ser usada como um modelo para macrófagos. Este organismo predatório, semelhante aos macrófagos, emprega fagocitose para matar células internalizadas. Com o auxílio de um microscópio confocal da laser-exploração, as imagens que descrevem momentos interativos entre pilhas e ameba criptocócica são capturadas. O poder da definição do microscópio de elétron igualmente ajuda a revelar o detalhe ultrastructural de pilhas criptocócica quando prendido dentro do vacuole do alimento do ameba. Como a fagocitose é um processo contínuo, os dados quantitativos são então integrados na análise para explicar o que acontece no momento em que uma imagem é capturada. Para ser específico, as unidades relativas da fluorescência são lidas a fim quantificar a eficiência do ameba em internalizantes pilhas criptocócica. Para esta finalidade, as pilhas criptocócica são manchadas com um corante que os faça fluorescência uma vez prendido dentro do ambiente ácido do vacuole do alimento. Quando utilizados em conjunto, as informações recolhidas através de tais técnicas podem fornecer informações críticas para ajudar a tirar conclusões sobre o comportamento e o destino das células quando internalizada pela ameba e, possivelmente, por outras células fagocíticas.
Introduction
Os micróbios evoluíram ao longo do tempo para ocupar e prosperar em diferentes nichos ecológicos, como os limites físicos abertos do solo e da água, entre outros1. Nesses nichos, os micróbios muitas vezes se envolvem na concorrência direta por recursos limitados; importante, para os nutrientes que eles usam para apoiar o seu crescimento ou espaço, que eles precisam para acomodar a população em expansão2,3. Em certos casos, alguns organismos holozoicos como a ameba podem até mesmo antecedem em células criptocócicas como uma forma de extrair nutrientes de sua biomassa4,5. Por sua vez, isso permite que tais organismos estabeleçam a dominância territorial através do controle dos números populacionais de suas presas. Devido a essa pressão predatória, algumas presas podem ser selecionadas para produzir fatores microbianos, como a cápsula criptocócica6, para conciliar os efeitos negativos da pressão. No entanto, como consequência não intencional desta pressão, alguns micróbios adquirem fatores que lhes permitem atravessar a barreira das espécies e procurar novos nichos para colonizar7, como os espaços confinados do corpo humano que são ricos em nutrientes e têm o ideal Condições. Este último pode explicar como um micródon terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pode se transformar para se tornar patogénico.
Para este fim, é importante estudar o contato inicial que as células criptocócicas podem ter com ameba e como isso pode selecioná-los para se tornarem patogênicos. Mais especificamente, isso pode dar pistas sobre como as células criptocócicas se comportam quando agiram por macrófagos durante a infecção. É por esta razão que a ameba foi escolhida como um modelo para os macrófagos aqui, pois é relativamente barata e fácil manter uma cultura de ameba em um laboratório8. Do interesse era examinar igualmente como Metabolites secundário criptocócica viz. os ácidos graxos 3-hydroxy9,10 influenciam a interação entre amebas e pilhas criptocócica.
Uma maneira simples de perceber a interação entre a ameba e sua presa a olho nu é criar um gramado usando sua presa na superfície de uma placa de ágar e ameba local. A visualização de placas ou zonas claras na placa de agar retrata áreas onde a ameba pode ter alimentado sua presa. No entanto, neste nível macro, apenas o resultado do processo é observado, e o processo de fagocitose é mecanizado não pode ser observado. Portanto, para apreciar o processo em uma base célula a célula, existem vários métodos microscópicos que podem ser usados11,12. Por exemplo, um microscópio invertido com uma câmara de incubação pode ser usado para gravar um lapso de tempo de eventos entre uma célula fagocítica e seu alvo13. Infelizmente, devido ao custo de um microscópio com uma funcionalidade de lapso de tempo, nem sempre é possível para os laboratórios para comprar tal microscópio, especialmente em recursos pobres-configurações.
Para contornar a limitação acima, este estudo apresenta um delineamento exploratório sequencial que avalia a interação de c. neoformans Viz c. neoformans uofs Y-1378 e c. neoformans Lmpe 046 com Acanthamoeba Castellani . Em primeiro lugar, é utilizado um método qualitativo que precede um método quantitativo. As imagens ainda são capturadas usando um microscópio de fluorescência invertido, bem como um microscópio eletrônico de transmissão para descrever ameba-interaçõesCryptococcus . Isto foi seguido quantificando a fluorescência usando um leitor da placa para estimar a eficiência do ameba para internalizar pilhas criptocócica. Ao reconciliar os achados desses métodos durante a fase de interpretação de dados, isso pode revelar igualmente tanta informação crítica quanto a utilização de um vídeo de lapso temporal de fagocitose.
Protocol
Representative Results
Discussion
No artigo, diferentes técnicas foram empregadas com sucesso para revelar o possível desfecho que pode surgir quando a ameba interage com células criptocócicas. Além disso, estávamos interessados em mostrar os efeitos dos ácidos graxos 3-hidroxi sobre o desfecho das interações Criptococcus-Amoeba.
A primeira técnica utilizada foi a microscopia confocal, que rendeu imagens ainda. A principal desvantagem desta técnica aqui foi que ele só nos deu informações que é limitada …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado por uma subvenção da Fundação Nacional de investigação da África do Sul (número de subvenção: UID 87903) e da Universidade do estado livre. Também estamos gratos aos serviços e assistência oferecidos por Pieter Van Wyk e Hanlie Grobler durante nossos estudos de microscopia.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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