Summary

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

Abstract

간, 내 림프 혈관 포털 깡패 내에서 발견 되 고 그들의 설명한 기능 세포 파편과 항을 조사 수 있는 림프절을 간에서 틈새 액체를 제거 하는. 우리는 림프 맥 관 구조 염증 및 간 내에서 면역 세포 기능에 관여 하는 수도 있습니다 어떻게 이해에 매우 관심이 다입니다. 그러나, 아주 작은 게시 된 간 또는 간 평가 하는 데 사용할 수 있는 특정 마커 (LECs)의 림프 내 피 세포의 고립에 대 한 소화 프로토콜 설정 LECs 당 셀 기준. 따라서, 우리는 소화와 간에서 LEC 인구를 평가 하기 위해 간 얼룩에 대 한 방법을 최적화 합니다. 우리는 여기에 설명 된 방법을 식별 및 간에서 LECs의 격리에 대 한 도움이 될 것입니다 LECs 간 microenvironment에 대응 하는 방법에 대 한 우리의 이해를 강화할 것 이다 확신.

Introduction

간에서 림프 혈관 및 LECs의 역할은 잘 이해 되지. 림프 혈관 간1 의 포털 3 인조 내의 질병2중 확장 하는 동안 아주 작은 기능 및 간 내 LECs의 표현 형에 관한 이해 된다. LECs3에 주로 발견 되는 마커의 발견과 항상성 및 질병에 다른 조직 틈새 내의 이러한 셀의 중요성 우리의 이해에 중요 한 격차를 채울 것입니다. LECs는 T 세포4,,56,7,8, 와 직접 상호 작용 하 여 림프 노드 및 전이성 종양 주변 공차를 유지 하는 주요 역할 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 림프 노드에서 LECs 철새 수지상 세포14,,1516와 그들의 상호 작용을 통해 보호 면역을 홍보할 수 있습니다. 따라서, 특정 조직에 있는 그들은 존재 하는 상호 작용 수 있는 LECs에 대 한 여러 역할이 있습니다. 그러나, 아주 작은 LECs 조직에서 면역 세포 상호 작용 하는 방법 또는 다른 기관 체계; LECs 작동 하는 방법에 대 한 이해는 따라서, 간 또는 다른 장기에서 세포 당 기준 LECs 평가 어떻게 LECs 조직 특정 면역 프로그램에서 발생할 수 있습니다. 문학에 초점을 맞춘 LECs 간에서 많이 LECs 하나 또는 두 개의 마커 및 형태학17를 사용 하 여 시각화를 현미경을 사용 하 여, 하는 동안 아주 작은 일 하고있다 특히 cytometry, 비록 한 연구를 사용 하 여 셀에 의해 셀 별로 LECs를 평가 하 한 간 사인 내 피 세포 (LSECs), LECs18간의 차이 평가. Cytometry 여 간에서 LEC 인구를 분석할 수 있는 정상적인 항상성 또는 질병 동안 LEC 표현 형의 심도 있는 연구에 대 한 수 있습니다.

LECs cytometry로를 평가 하려면 여러 표면 마커 필요 합니다. 일반적으로, LECs 지주 님 관련 homeobox 1의 표현 (Prox-1), 림프 혈관 내 피 hyaluronan 수용 체 1 (LYVE1) 또는 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 3 (VEGFR3) 현미경을 사용 하 여 시각화 됩니다. 그러나,이 간,이 마커의 식 LECs 제한 되지 않습니다. Prox 1 널리 간 개발, 재생, 및 부상19, hepatocytes에 의해 표현 하 고 LYVE1 및 VEGFR318간 사인 내 피 세포 의해 표현 됩니다. 림프절, LECs cytometry 차별화 (CD)의 클러스터로 사용 하 여 식별 됩니다 CD45-CD31 +, podoplanin + (PDPN)16. 그러나,이 방법은 너무 CD45-CD31 + 세포는 내 피 세포와 간에서 혈관 내 피 세포의 주된 인구는 LSECs 이후 간에서 LECs을 최소 이다. 따라서, 다른 마커는 풍부한 LSEC 인구에서 드문 LEC 인구 구분 필요 합니다. CD16/32 (성숙 LSECs18에 의해 표현)와 CD146 (일반적인 혈관 내 피 세포 마커를 주로 림프 여 식이 없는 거의 간 사인 내 피 세포20 여 간 사인 내 표현 내 피 세포21) 후보 마커를 했다.

따라서, 우리는 분리 하 고 간 cytometry에 대 한 위의 마커, CD45, CD31, CD146, CD16/32, 및 PDPN를 사용 하 여에서 LECs을 시각화 하는 방법을 최적화 합니다. 우리는 콜라 4의 사용, DNase 1, 및 단일 셀 서 스 펜 션에 간 조직 소화에 대 한 기계적 분리 설명합니다. 우리는 또한 세포질 파편을 제거 하 고 비 parenchymal 세포 (NPC)의 분리에 대 한 iodixanol 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 주된 마커로 PDPN 간에서 LECs을 식별 하는 최적의 흐름 cytometry 제어 전략을 결정 마지막으로, 여러 개의 마커를 사용 하 여, 우리.

Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 콜로라도 대학 Anschutz 의료 캠퍼스의 승인 되었습니다. 1입니다. 자료의 준비 5 mg/mL 솔루션 DNase의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 내가. 클릭의 EHAA 미디어 콜라 IV의 5000 U/mL을 추가 하 여 소화 혼합물 을 확인 합니다. 사용 하기 30 분 전에 37 ° C에서 소화 혼합 따뜻…

Representative Results

간 lymphatics를 분석 하는 연구는 주로 주파수와 간에서 림프 혈관의 직경을 quantitate 하 immunohistochemistry를 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 셀에 의해 셀 기준 LECs의 평가 대 한 또는 여러 마커, cytokines, 발산, 또는 녹음 방송 요인의 표현에 대 한 허용 하지 않습니다. 따라서, 우리는 물었다 간 여부 LECs 간 으로부터 격리 될 수 있고 cytometry 사용 하 여 평가. 림프절 LECs 분리 이…

Discussion

25LECs의 전반적인 중요성 면역 항상성 그리고 규칙에 최근에 왔다. 게시 된 림프 문학의 많은 피부와 림프절;에 초점을 맞추고합니다 그러나, lymphatics26 신체 걸쳐 발견 되 고, 따라서, 다른 기관에 그들의 중요성의 우리의 이해는 필요 하다. 여기 우리가 다른 표면 마커, cytokines, 발산, 및 녹음 방송 요인 등 세포내 단백질의 그들의 동시 표현 이해 하기 셀에 의?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 기 및 간 타고 난 면역 프로그램이이 프로젝트의 통화 지원에 감사 하 고 싶습니다. B.A.J.T.는 또한 R01 AI121209에 의해 자금을.

Materials

Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100um cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 ml conical Truline TR2004
15 ml conical Falcon 352196
1 ml Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µl pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µl pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10ml pipete greiner bio-one 607107
seriological 5ml pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

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Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

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