Summary

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Het doel van dit protocol is het identificeren van lymfatische endothelial cel populaties binnen de lever beschreven markeringen gebruiken. Wij gebruiken collagenase IV en DNase en een zachte hakken van weefsel, gecombineerd met stroom cytometry, ter identificatie van een aparte populatie van lymfatische endotheliale cellen.

Abstract

Binnen de lever, lymfevaten binnen de portal triad worden gevonden, en hun beschreven functie is om de interstitiële vloeistof van de lever naar de lymfeklieren waar cellulaire puin en antigenen kunnen worden onderzocht. Wij zijn zeer geïnteresseerd in het begrip van hoe de lymfatische therapieën kan worden betrokken bij de ontsteking en immuun cel functie binnen de lever. Echter zeer weinig is gepubliceerd tot oprichting van de spijsvertering protocollen voor de isolatie van lymfatische endotheliale cellen van de lever of de specifieke markeringen die kunnen worden gebruikt voor het evalueren van de lever (LECs) LECS-server op basis van de per cel. Daarom geoptimaliseerd we een methode voor de spijsvertering en de kleuring van de lever om te evalueren van de LEC-bevolking in de lever. Wij zijn ervan overtuigd dat de hier geschetste methode nuttig voor de identificatie en de isolatie van de LECS-server uit de lever zijn zal en ons begrip van hoe de LECS-server op de lever communicatie reageren zal versterken.

Introduction

De rol van lymfevaten en de LECS-server in de lever niet goed wordt begrepen. Terwijl lymfevaten zijn te in de portal triade van de lever1 vinden en uit te tijdens ziekte2 breiden, is weinig begrepen met betrekking tot de functie en het fenotype van de LECS-server binnen de lever. Met de ontdekking van de markeringen die zijn gevonden voornamelijk op de LECS-server3, vult het belang van deze cellen binnen verschillende weefsel niches in de homeostase en ziekte een belangrijke leemte in ons begrip. LECS-server hebben een belangrijke rol bij het handhaven van perifere tolerantie in de lymfeklier en gemetastaseerde tumoren door direct interactief werken met T cellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in de lymfeklier protectieve immuniteit via hun interacties met15,16van de14,van de trekkende dendritische cellen kunnen bevorderen. Daarom zijn er meerdere functies voor LECs die specifiek zijn voor de weefsels en interacties waarin ze aanwezig zijn. Maar is weinig begrepen over hoe de LECS-server interactie met immune cellen in het weefsel of hoe LECs functioneren in verschillende orgaansystemen; Dus, LECs evalueren op basis van per cel binnen de lever of andere organen kan leiden tot vooruitgang in hoe LECs program weefsel-specifieke immuniteit. Terwijl veel van de literatuur die zich op de LECS-server in de lever richt microscopie gebruikt om te visualiseren LECS-server met behulp van één of twee markeringen en morfologie17, is heel weinig gedaan om de LECS-server specifiek te evalueren op basis van cel voor cel met behulp van stroom cytometry, hoewel een studie verschillen tussen sinusvormige endotheliale cellen van de lever (LSECs) en LECs18evalueren. Kunnend analyseren LEC populaties in de lever door stroom cytometry voorziet de grondige studie van LEC fenotype tijdens normale homeostase of ziekte.

Om te beoordelen LECs door stroom cytometry, zijn meerdere oppervlakte markeringen nodig. Typisch, LECs worden gevisualiseerd door de expressie van prospero-gerelateerde homeobox 1 (Prox-1), de lymfatische vaartuig endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) of de vasculaire endotheliale groeifactor receptor 3 (VEGFR3) met behulp van microscopie. In de lever is de uitdrukking van deze markers echter niet beperkt tot de LECS-server. ProX-1 is wijd van hepatocyten tijdens lever ontwikkeling, regeneratie en letsel19, en LYVE1 en VEGFR3 worden geuit door de endotheliale cellen van de lever sinusvormige18. In de lymfeklier, LECs worden geïdentificeerd met behulp van stroom cytometry als clusters van differentiatie (CD) CD45 – CD31 + en podoplanin + (PDPN)16. Deze aanpak is echter ook minimale LECs in de lever te isoleren omdat CD45 – CD31 + cellen endotheliale cellen vangen zal, en de overheersende bevolking van vasculaire endotheliale cellen in de lever LSECs zijn. Zo nodig andere markeringen zijn te onderscheiden van de zeldzame LEC-bevolking uit de overvloedige LSEC populatie. Zowel CD16/32 (uitgedrukt door volwassen LSECs18) en CD146 (een gemeenschappelijke vasculaire endothelial cel markering die wordt hoofdzakelijk binnen de lever sinusoïdes uitgedrukt door endotheliale cellen van de lever sinusvormige20 met weinig tot geen expressie door lymfatisch endotheliale cellen21) werden kandidaat-markeringen.

Daarom geoptimaliseerd we een methode voor het opsporen en visualiseren van de LECS-server in de lever met behulp van de bovenstaande markeringen, CD45, CD31, CD146, CD16/32 en PDPN voor stroom cytometry. We beschrijven het gebruik van collagenase IV, DNase 1 en mechanische scheiding voor leverweefsel vertering in de schorsing van een eencellige. Ook beschrijven we het gebruik van iodixanol dichtheid verloop voor de isolatie van niet-parenchymal cellen (NPC) en te elimineren cellulaire puin. Ten slotte, met behulp van meerdere markeringen, we de optimale stroom cytometry gating strategie te identificeren van de LECS-server van de lever met PDPN als overheersende markering bepalen.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Colorado Anschutz medische Campus. 1. voorbereiding van de materialen Maak een oplossing van 5 mg/mL van DNase ik in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Maak een mengsel van de spijsvertering door 5.000 U/mL collagenase IV aan Klik op de EHAA media toe te voegen. Verwarm het mengsel van…

Representative Results

Studies analyseren lever lymfatische hebben hoofdzakelijk immunohistochemistry gebruikt aan het kwantificeren van de frequentie en de diameter van de lymfevaten in de lever. Echter, deze methode niet mogelijk voor de evaluatie van de LECS-server op basis van de cel-door-cel of voor de expressie van meerdere markeringen, cytokines, chemokines of transcriptiefactoren. Dus we vroegen of lever LECs kon worden geïsoleerd uit de lever en geëvalueerd aan de hand van stroom cytometry. Vorige we…

Discussion

Het algemene belang van LECs in immuun homeostase en verordening gekomen onlangs tot lichte25. Veel van de gepubliceerde lymfatische literatuur focust op de huid en lymfklieren; echter, lymfatische worden aangetroffen in het lichaam26 , en dus ons begrip van hun belang in verschillende organen nodig is. Hier laten we een methode waarin de LECS-server in de lever kunnen worden bestudeerd op basis van cel-door-cel om hun gelijktijdige uitdrukking van verschillende oppervlakte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedank de GI en lever aangeboren immuun programma’s voor monetaire steun voor dit project. B.A.J.T. wordt ook gefinancierd door R01 AI121209.

Materials

Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100um cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 ml conical Truline TR2004
15 ml conical Falcon 352196
1 ml Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µl pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µl pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10ml pipete greiner bio-one 607107
seriological 5ml pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

References

  1. Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
  2. Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
  3. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  4. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  5. Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
  6. Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
  7. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
  8. Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
  9. Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
  10. Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
  11. Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
  12. Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
  13. Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
  14. Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
  15. Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
  16. Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
  17. Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver–re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
  18. Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
  19. Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from “oval cells”. Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
  20. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  21. Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
  22. Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
  23. Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
  24. Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
  25. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
  26. Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).

Play Video

Cite This Article
Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

View Video