Summary

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist, lymphatische Endothelzellen Populationen innerhalb der Leber mit den beschriebenen Markern zu identifizieren. Wir nutzen Kollagenase IV und DNase und eine sanfte Zerkleinerung des Gewebes, kombiniert mit Durchflusszytometrie, um eine verschiedene Bevölkerung der lymphatische endothelial Zellen zu identifizieren.

Abstract

In der Leber Lymphgefäße befinden sich innerhalb des Portals Dreiklang, und ihre beschriebene Funktion soll interstitielle Flüssigkeit aus der Leber, die Lymphknoten zu entfernen, wo Zelltrümmer und Antigene befragt werden. Wir sind sehr daran interessiert, zu verstehen wie das lymphatische Gefäßsystem in Entzündung und Immunzelle Funktion innerhalb der Leber beteiligt sein könnten. Jedoch sehr wenig veröffentlicht wurden zur Gründung Verdauung Protokolle für die Isolierung von lymphatische Endothelzellen (LECs) aus der Leber oder spezifischer Marker, die verwendet werden, um die Leber zu bewerten LECs pro Zelle. Daher haben wir eine Methode für die Verdauung und das Beflecken der Leber für die Beurteilung die LEC-Bevölkerung in der Leber optimiert. Wir sind zuversichtlich, dass die hier beschriebene Methode nützlich für die Identifizierung und Isolierung von LECs aus der Leber ist und stärkt unser Verständnis wie LECs auf die Leber Mikroumgebung reagieren.

Introduction

Die Rolle der Lymphgefäße und LECs in der Leber ist nicht gut verstanden. Während Lymphgefäße finden Sie unter dem Portal Dreiklang aus der Leber1 und Krankheit2auszubauen, ist sehr wenig über die Funktion und den Phänotyp der LECs innerhalb der Leber verstanden. Mit der Entdeckung von Markern, die in erster Linie auf LECs3gefunden werden, wird die Bedeutung dieser Zellen in verschiedene Gewebe Nischen in Homöostase und Krankheit eine bedeutende Lücke in unserem Verständnis füllen. LECs haben eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz in den Lymphknoten und metastasierten Tumoren durch die Interaktion direkt mit T Zellen4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs in den Lymphknoten können schützende Immunität über ihre Interaktionen mit wandernden dendritischen Zellen14,15,16fördern. Daher gibt es mehrere Rollen für LECs möglicherweise spezifisch für die Gewebe und Interaktionen, in denen sie vertreten sind. Jedoch sehr wenig verstanden wie LECs mit Immunzellen im Gewebe interagieren oder LECs in verschiedenen Organsystemen Funktionsweise; so kann die Bewertung LECs auf einer Basis pro Zelle innerhalb der Leber oder andere Organe zu Fortschritte in der wie LECs Gewebe-spezifische Immunität Programm führen. Während ein Großteil der Literatur, die in der Leber auf LECs konzentriert Mikroskopie nutzt, um mit ein oder zwei Markierungen und Morphologie17LECs zu visualisieren, wurde sehr wenig getan, um speziell LECs anhand einer Zelle für Zelle Durchflusszytometrie, obwohl eine Studie bewerten Unterschiede zwischen sinusförmigen endothelial Zellen der Leber (LSECs) und LECs18bewerten. Möglichkeit, LEC Populationen in der Leber durch Durchflusszytometrie analysieren können für die eingehende Untersuchung der LEC Phänotyp bei normalen Homöostase oder Krankheit.

Um LECs durch Durchflusszytometrie zu bewerten, werden mehrere Oberflächenmarker benötigt. In der Regel sind LECs durch den Ausdruck von Prospero-bezogene Homeobox 1 (Prox-1), Lymphgefäßsystem endotheliale Hyaluronan Rezeptor 1 (LYVE1) oder vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor Rezeptor 3 (VEGFR3) mit Mikroskopie visualisiert. Jedoch ist der Ausdruck dieser Marker in der Leber nicht auf LECs beschränkt. Prox-1 drückt sich häufig durch Hepatozyten während Leber Entwicklung, Regeneration und Verletzungen19, und LYVE1 und VEGFR3 durch die Leber sinusförmigen Endothelzellen18ausgedrückt werden. In den Lymphknoten werden LECs durch Durchflusszytometrie als Cluster der Differenzierung (CD) identifiziert CD45 – CD31 + und Podoplanin + (PDPN)16. Dieser Ansatz ist jedoch zu gering, LECs in der Leber zu isolieren, da CD45 – CD31 + Zellen werden Endothelzellen zu erfassen, und die überwiegende Bevölkerung von vaskulären endothelialen Zellen in der Leber LSECs sind. Daher sind andere Markierungen erforderlich, um die seltenen LEC Bevölkerung aus der reichlich LSEC Bevölkerung zu unterscheiden. CD16/32 (ausgedrückt durch ausgereifte LSECs18) und CD146 (eine gemeinsame vaskulären Endothelzellen Symbol, das sich überwiegend innerhalb der Leber Sinusoide geäußerten Leber sinusförmigen Endothelzellen20 mit wenig bis kein Ausdruck von lymphatischen Endothelzellen21) wurden Kandidaten Marker.

Daher haben wir eine Methode zur Isolierung und Visualisierung LECs in der Leber, die mit den oben genannten Markierungen, CD45 CD31, CD146, CD16/32 und PDPN für Durchflusszytometrie optimiert. Wir beschreiben die Verwendung von Kollagenase IV, DNase 1 und mechanische Trenntechnik für Lebergewebe Verdauung in eine einzelne Zelle-Suspension. Wir beschreiben auch die Verwendung des Iodixanol Dichtegradient für die Isolierung von nicht-parenchymal Zellen (NPC) und Zelltrümmer zu beseitigen. Zu guter Letzt ermitteln mit mehreren Markern, wir die optimalen Fluss Cytometry gating Strategie LECs aus der Leber mit PDPN als die vorherrschende Marker zu identifizieren.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt. 1. Vorbereitung der Materialien Machen Sie eine 5 mg/mL Lösung der DNase I Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Machen Sie eine Mischung der Verdauung durch Zugabe von 5.000 U/mL der Kollagenbildung IV, klicken Sie auf die EHAA Medien. Wärmen Sie die Verdauung Mi…

Representative Results

Studien analysieren Leber Lymphgefäße haben in erster Linie Immunohistochemistry verwendet, um die Häufigkeit und den Durchmesser der Lymphgefäße in der Leber quantitate. Diese Methode erlaubt allerdings nicht für die Bewertung der LECs auf Basis einer Zelle für Zelle oder Ausdruck mehrerer Marker, Zytokine, Chemokine oder Transkriptionsfaktoren. Also, wir fragten ob Leber LECs isoliert aus der Leber werden konnte und mittels Durchflusszytometrie. Isolieren von Lymphknoten LECs Vor…

Discussion

Die allgemeine Bedeutung der LECs immun Homöostase und Verordnung ist vor kurzem zum leichten25gekommen. Ein Großteil der veröffentlichten lymphatischen Literatur konzentriert sich auf Haut und Lymphknoten; Allerdings Lymphgefäße findet man überall in den Körper-26 und unser Verständnis ihrer Bedeutung in verschiedenen Organen ist also erforderlich. Hier zeigen wir eine Methode in der LECs in der Leber untersucht werden können auf eine Zelle für Zelle Basis ihren …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten den GI und Leber angeborene Immune Programme für finanzielle Unterstützung dieses Projektes danken. B.A.J.T. wird auch von R01 AI121209 finanziert.

Materials

Clicks/EHAA media Irvine Scientific 9195
Collagenase IV Worthington Biochemical corporation LS004188
DNase I Worthington Biochemical corporation LS002145 Deoxyribonuclease 1
OptiPrep Sigma Aldrich D1556 Density Gradient Medium
V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1 BD biosciences 562232
FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1 Biolegend 134706 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) Biolegend 102422
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390) Biolegend 102420 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) Biolegend 127410 Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)
APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103116
Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11 Biolegend 103138
FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) Biolegend 101306 Fluorescein isothiocyanate (FITC)
PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93) Biolegend 101324 Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)
ghost red 780 viability dye TONBO biosceinces 3-0865-T100
APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) Biolegened 402102
PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) Biolegend 400531
FITC rat IgG2 (clone eBR2a) ebioscience 1-4321-80
Anti mouse LYVE1 (clone 223322) R&D systems FAB2125A
anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) abcam ab181598
anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) Bio-rad MCA497
BSA (fraction V) Fischer BP1600-100 Bovine Serum Albumin (BSA)
Goat serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121
EDTA VWR E177 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer
Ammonium Chloride Fischer A687-500 for RBC Lysis buffer
Potassium Bicarbonate Fischer P184-500 for RBC Lysis buffer
Scalpel Feather 2975#21
100um cell strainer Fischer 22363549
2.4G2 in house/ATCC ATCC HB-197 FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14185-052
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta biologicals S11550
96 well plate Corning 3788
6 well plate Corning 3506
50 ml conical Truline TR2004
15 ml conical Falcon 352196
1 ml Pipete tip USA scientific 1111-2721
200 µl pipete tip USA scientific 1110-1700
10 µl pipete tip USA scientific 1111-3700
seriological 10ml pipete greiner bio-one 607107
seriological 5ml pipete greiner bio-one 606107
Cell incubator Fischer Heracell 160i
BD FacsCanto II flow cytometer BD biosciences
Clinical Centrifuge Beckman coulter model X-14R

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Finlon, J. M., Burchill, M. A., Tamburini, B. A. J. Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (143), e58621, doi:10.3791/58621 (2019).

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