Este protocolo diagnóstico de Virus de lago de Tilapia (TiLV) en tejidos de tilapia utilizando metodologías de RT-PCR. El método completo se describe de la disección del tejido para extracción de RNA total, seguida de la síntesis de cDNA y detección de TiLV por PCR convencional o PCR cuantitativa utilizando dsDNA vinculante un tinte fluorescente vinculante.
El objetivo de este método es facilitar la detección rápida, sensible y específica de Virus de lago de Tilapia (TiLV) en los tejidos de la tilapia. Este protocolo se puede utilizar como parte de programas de vigilancia, las medidas de bioseguridad en laboratorios de investigación básica TiLV. El patrón oro del diagnóstico de virus implica típicamente el aislamiento del virus seguido por técnicas complementarias como la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para la verificación de más. Esto puede ser engorroso, lento y requiere típicamente pesadamente infectadas con el virus de muestras de tejido. El uso de RT-cuantitativo (q) PCR en la detección de virus es ventajoso debido a su naturaleza cuantitativa, alta sensibilidad, especificidad, escalabilidad y su rápido tiempo de respuesta como resultado. Aquí, el método completo de PCR basado en enfoques para TiLV detección se describe, de tilapia órgano seccionamiento total ácido ribonucleico (ARN) extracción con una solución de tiocianato-fenol-cloroformo guanidínicos, cuantificación de RNA, seguido de una PCR de dos pasos Protocolo que entrañan, síntesis de ácido desoxirribonucleico complementario (cDNA) y detección de TiLV por PCR convencional o identificación cuantitativa mediante qPCR utilizando verde de SYBR tinte. PCR convencional requiere pasos de post-PCR y simplemente le informará sobre la presencia del virus. Este último enfoque permitirá una cuantificación absoluta de TiLV hasta tan poco como 2 copias y por lo tanto es excepcionalmente útil para la diagnosis de TiLV en casos subclínica. Una descripción detallada de los dos métodos PCR, resultados representativos de dos laboratorios y una discusión cuidadosa de los parámetros críticos de ambos han sido incluidas para que investigadores y diagnosticadores encuentran su más adecuada y aplicable método de detección TiLV.
El suministro de pescado per cápita global alcanzó un nuevo récord de 20 kg en 2014 y esto era debido a un crecimiento vigoroso en la acuicultura. La acuicultura sigue siendo uno de los mayor crecimiento pienso producir sectores en todo el mundo y es el sector de producción de alimentos sólo animales que está creciendo más rápido que la población humana1. Cichilds tilapina comprenden el segundo pez de agua dulce cultivado en todo el mundo con una producción mundial total de 6,4 millones de toneladas (MT) y un valor estimado de 9,8 billones de dólares en 20152. El top 10 los productores de tilapia son China (1.78 MT), Indonesia (1.12 MT) y Egipto (0.88 MT), seguido por Bangladesh, Vietnam, Filipinas, Brasil, Tailandia, Colombia y Uganda2. Se espera que la producción mundial de tilapia será alrededor de 7.3 MT por 20303. Tilapia se han convertido en una fuente de alimento mundial importante, no sólo porque son una fuente barata de proteína4 sino también porque son fáciles de criar en capacidad bajo una amplia gama de agua y el clima condiciones5,6. Hace unas décadas se creía que había pocas enfermedades comercialmente importantes que amenazan el cultivo de tilapia, pero esto no es cierto. Una enfermedad viral llamada enfermedad de virus de lago de tilapia (TiLVD) es la primera epidemia de la enfermedad siempre crítico encontrado en tilapia y toda la industria está en riesgo. Esta enfermedad tiene graves consecuencias socio-económicas y es una amenaza directa sobre la seguridad alimentaria de millones de personas en África7, Asia y América del sur. En el comienzo del 2018, la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) informó que el agente etiológico de esta enfermedad, TiLV, había sido detectado oficialmente en tres continentes, cubriendo ocho países8 y desde la ficha de este patógeno actualizado se ha informado más de TiLV en Tanzania, Uganda9, Indonesia10, Taiwán11 y Perú12. TiLV es un virus de ARN monocatenario novela se describe para ser un ortomixo-como virus ya que contiene una variedad de características que recuerdan a otros orthomyoxoviruses como gripe o infecciosa salmon anemia virus (ISAV)13. Primero fue identificado en las secuelas de pérdidas masivas de tilapias silvestres y cultivados en el lago de Galilea, Israel14. Después de eso, los brotes de enfermedades similares que se refiere como mortalidades de verano y un mes síndrome de mortalidad asociado a infección TiLV informaron en tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) en Egipto15 y Nilo y la tilapia híbrida roja (Oreochromis spp.) en Tailandia16, respectivamente. Detección de los virus animales acuáticos históricamente se realiza por aislamiento del virus en cultivo celular y crecimiento. Varias líneas celulares han sido probadas para la propagación y el aislamiento de TiLV incluyendo, E-11 en células de snakehead peces (striatus de Ophiocephalus)17,18, OmB y TmB procedentes de Oreochromis mossambicus18y OnlB y OnlL originarios del Nilo tilapia (o. niloticus)19. Mientras que el cultivo de virus tiene la ventaja que proporciona material para otros experimentos, tiene la desventaja que requiere al menos 4-7 días para observar la formación de efectos citopáticos (CPE) y crucial, diversos virus piscine, más apto para repetición puede ser propagado y producir CPE similar.
En las últimas décadas, ha habido un movimiento lejos de tradicionales, a menudo lentos métodos diagnósticos como el cultivo celular, serología y detección del antígeno y reemplazo con ácido nucleico más rápido y más sensible en la detección de pruebas20, 21. Esto es evidente por el hecho de que muchos ensayos de qPCR se han desarrollado como importantes métodos de diagnóstico para un sinfín de enfermedades virales en animales acuáticos, como vais22,23, virus hemorrágico viral del septicaemia (VHSV)24 ,25betanodavirus26,27 Alfavirus28, pescado iridovirus29, migración herpesvirus 1 (AngHV1)30y Lymphocystis enfermedad virus (LCDV)31 . Métodos robustos para vigilancia diagnóstico y patógeno son urgentemente necesarios para reducir la propagación de TiLV. Estos métodos deberían permitir la detección temprana de la infección antes de desarrollan signos clínicos y la detección de virus bajo cargas. Hasta la fecha, distintos protocolos PCR como RT-PCR14,32, RT-PCR anidada18, RT-PCR semi-anidada33y RT-qPCR32,34 han sido desarrollados para la detección de TiLV en tejidos de peces. Una comparación de RT-qPCR y aislamiento viral en líneas celulares susceptibles de detección TiLV reveló que RT-qPCR fue 1.000 veces más sensible que el aislamiento de virus32. Aunque cada protocolo PCR publicado ha divulgado diferentes sensibilidades para la detección de TiLV, la mayoría de ensayos son muy sensibles con los límites de detección de copias virales en 7.5 copias33, 7 copias18 o 2 copias32 por reacción.
El objetivo de este artículo de métodos es explicar, detalladamente, cómo llevar a cabo ensayos de detección TiLV, comenzando con la colección de tejidos de tilapia, a la extracción de RNA total, síntesis de cDNA y luego TiLV PCR específico basado en ensayos. Específicamente, se han descrito protocolos integrales de RT-PCR convencional y también basados en verde SYBR RT-qPCR para apelar a una amplia gama de científicos con el objetivo de detectar TiLV. El primero es menos sensible pero suele ser una opción más barata de detección. Este último requiere de infraestructura más elaborada como una máquina PCR cuantitativa y reactivos más costosos, pero tiene las ventajas de ser cuantitativa, rápida y muy sensible, lo que significa que puede ser utilizado para la detección de TiLV en sub-clínicamente peces infectados. La RT-PCR y RT-qPCR protocolos fueron realizados en dos laboratorios diferentes con distintas cepas geográficas de TiLV y el resaltado de resultados incluye la sensibilidad y reproducibilidad de los ensayos aquí descritos.
TiLV primero fue divulgado en 2014 en Israel14 y desde entonces, ha sido identificado en varios países incluyendo Egipto, Colombia, India, Malasia, Uganda, Tanzania y Tailandia15,16,18, 35 , 48. conciencia global, en particular, en países productores de tilapia ha puesto más atención en el virus y diversas restricciones y se han implementado medidas de control de las autoridades del gobierno tratar de evitar la propagación de TiLV. Aquí, un protocolo detallado para la detección de TiLV en tejido de tilapia, que cubre la recogida de muestras, aislamiento de RNA, análisis síntesis, PCR y qPCR de cDNA se ha explicado. Hay varios aspectos a estos métodos que merecen una discusión específica. TiLV ha sido identificado en los peces que abarca una variedad tamaños9,12,14,15,49 y especies de tilapia, incluyendo cultivo híbrido de tilapia (O. niloticus x o. aureus)11,14, Nilo tilapia (o. niloticus)9,10,14,15,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 y rojo de la tilapia (Oreochromis SP.)16,33,48,51, como así como en la salvaje Nilo tilapia9,12, negro tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, o. aureus y T. simonis intermedia14 y muy recientemente TiLV fue identificado en carpa silvestre (Barbonymus schwanenfeldii)52. Muestras de tejido de órganos internos (gill, bazo, hígado, corazón, riñón principal) o moco37 pueden ser recogidas de tilapia sano como moribundo sin importar la edad, tamaño o especie y procesadas para el aislamiento de RNA. El protocolo de extracción de RNA total se indica aquí utiliza una solución monofásica de fenol y Guanidinio tiocianato, que es un agente de desnaturalización caotrópico. Los tejidos son homogeneizados directamente en esta solución seguida por la adición de cloroformo y centrifugación para lograr la separación de la fase en la que se genera un claro RNA que contiene la fase acuosa superior, una interfase y una fase orgánica inferior. El ARN está aislado de la fase acuosa por la precipitación del isopropanol, seguida de lavado del ARN recuperado para deshacerse de los contaminantes. Aislamiento del ARN de esta metodología fue pionero Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi y fue referido como Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo extracción53,54. Este tipo de reactivo utilizado para la extracción de RNA puede ser comprado comercialmente o hecho en el laboratorio (véase la Tabla de materiales para más información). Este protocolo tiene un poco más de los métodos basados en la columna como la purificación basados en sílice, pero en general, es más rentable y da más RNA.
En este protocolo de cuantificación de RNA utilizando valores de A260 fue delineado por el que los valores de la espectrofotometría pueden indicar calidad de RNA (A260/A280 = 1.9-2.1). Mientras que este método dará una buena indicación de la pureza de la muestra, absolutamente no puede informar sobre la calidad del ARN extraído. Determinar correctamente si el ARN es intactas o parcialmente degradadas, las muestras pueden ser separación por electroforesis del gel de agarosa que mancharse de la EtBr manchado de 18 años y bandas de 28S rRNA indican degradación del RNA. Para verificación de calidad de RNA puede incluyen el uso de un instrumento de laboratorio en un chip. Además, también es importante para digerir el ARN purificado con DNasa I para eliminar contaminantes acoge la DNA genomic, que dependiendo de las aplicaciones posteriores puede conducir a resultados falsos. Si host gDNA todavía está contaminando la muestra de RNA en gran parte, también se puede realizar un tratamiento adicional de la DNaseI al final del procedimiento de extracción de RNA (véase Tabla de materiales).
La síntesis de ADN complementaria puede afectar en gran medida los resultados globales de la qPCR y es un aspecto del método que puede presentar variación. El protocolo de cDNA abogado aquí dispone de una configuración de un solo componente con oligo (dT) y así sólo transcribe mRNAs que contienen colas polyA. Permite el control de usuario de exactamente qué componentes a utilizar en la reacción de transcripción reversa y este modo de cDNA síntesis ha demostrado su eficacia para la detección de TiLV32. Una alternativa a esta configuración es una mezcla maestra compradas comercialmente que contiene todos los componentes necesarios para la reacción de transcripción reversa y es muy rápida y sencilla sin el protocolo habitual de multi-step, pipeteo y multi-temperatura. Esto es ventajoso porque reduce al mínimo la manipulación y promueve la uniformidad en todas las muestras. Tal maestro-se mezcla a menudo incluye oligo(dT) y cartillas al azar lo que es aplicable a diferentes plantillas del RNA y generar cDNA representante copias de secuencias de toda la longitud de los RNAs en una población (viral y anfitrión mRNA) y en teoría, puede medirse entonces cada especie deseada de RNA por PCR convencional o por qPCR de tal muestra. Esta versatilidad es la principal ventaja de un enfoque de RT-PCR de 2 pasos; ofrece una piscina a largo plazo que puede ser utilizada para muchos diversos experimentos. En los resultados, se ha representado un método de RT-PCR de un paso en donde se utilizaron primers específicos de secuencia (tabla 1) y la RT y PCR fueron realizadas en un tubo (véase lista de materiales). En general, primers específicos de secuencia permiten una mayor eficiencia de RT de la RNA específicos que el uso de cebado al azar, pero el objetivo específico de RNA es el único que puede cuantificarse en tal una muestra de cDNA que puede ser el único objetivo de ciertos laboratorios (ver Tabla de materiales para sugerencias de producto de síntesis de cDNA).
Mientras que RT-PCR convencional parece ser utilizados hasta ahora en el TiLV diagnóstico9,13,14,15,16,17,18, 33 , 35 , 48 , 55. RT-qPCR ha demostrado ser una herramienta más poderosa para la detección y cuantificación de pequeñas cantidades de TiLV en tejidos de peces o moco32,37. En general, qPCR es ampliamente utilizado en los laboratorios de diagnóstico de virología clínica debido a su alta sensibilidad, especificidad, buena reproducibilidad, amplio rango dinámico y velocidad21. QPCR puede ser inicialmente más caro de implementar que RT-PCR convencional, ofrecen muchas ventajas importantes sobre PCR convencional; tiene un más rápido tiempo de vuelta de la muestra resultados y no requiere ninguna medida de post-PCR. Este último punto significa que existe un riesgo mínimo de contaminación del laboratorio y se puede adaptar más fácilmente a situaciones de alto rendimiento como en el caso de brotes. Por otra parte, es inherentemente más sensible que los RT-PCR convencional, que es de vital importancia para detectar cargas virales bajas en infecciones sub clínicas21. Esto requeriría un enfoque PCR anidado requiere transcripción inversa, dos más reacciones de PCR y análisis de agarosa electroforesis del gel. Estos pasos muchos toman mucho tiempo y aumentan las posibilidades de errores o de contaminación. Sin embargo, debido a su alta sensibilidad, RT-qPCR exige diseño experimental meticuloso y un conocimiento profundo de las técnicas de cuantificación para generar resultados precisos56,57.
El ADN vinculante fluoróforo, SYBR Green se ha demostrado en el presente Protocolo. Es un tinte de unión de ADN inespecífico dsDNA y así la especificidad del ensayo se encuentra enteramente en el sistema de cartillas, que pueden generar falsos positivos58. Por lo tanto, mientras que el dsDNA fusión realizado al final de cada PCR Análisis de la curva es una parte especialmente importante de la reacción de PCR porque confirma que sólo un amplicon PCR de T correctom se produce (esto se debe también alcanzar por gel electroforesis, cuando se llevan a cabo nuevos ensayos). Tm de un fragmento de ADN depende de una variedad de características tales como su longitud, composición de GC, secuencia, filamento de la complementariedad, así como en la concentración del almacenador intermediario componentes y potenciadores de la polimerización en cadena. Los análisis de la curva fusión los resultados representativos que se muestra de dos laboratorios no reveló la presencia de dímeros de primer o de otros productos PCR no deseados pero si esto se observa con otras muestras y preparaciones para experimentos, el análisis debe ser volver a optimizado. Tecnologías más avanzadas de la qPCR no requieren tal fusión paso de curva y de hecho, desde este papel fue escrito, los métodos un TaqMan basado TiLV RT-qPCR se ha desarrollado utilizando dos iniciadores y sonda haciéndolo altamente TiLV específicas34.
Sin duda, los cebadores diseñados para los ensayos de RT-qPCR son fundamentales para el éxito del ensayo y aquí los cebadores fueron diseñados en base a los disposición del público datos genómicos TiLV en tiempo32. Sin embargo, los virus ARN son bien sabidos para exhibir tasas de mutación alta y posibles tensiones escaparán las pruebas diagnósticas actuales, como fue observado por ISAV59. Siempre va a ser difícil para tales tipos de virus generar un RT de pan-TiLV universal-ensayo qPCR y estos ensayos sólo continuamente mejorará si disponga de más datos genómicos TiLV de gran alcance lugares y periodos de tiempo.
Finalmente, es esencial ejecutar duplicadas o triplicadas si es posible, las reacciones en ambos intra y inter ensayos de qPCR. Si los valores det de C son muy altos, el uso de repeticiones es especialmente importante comprobar que la reacción de PCR es confiable y reproducible. En general, si replican datos de reacciones varía más de 0,5 ciclos, las reacciones debe repetirse y si los valores det de C varían constantemente ciclos de > 0,5 en replica, el ensayo debe volver a optimizar. El uso de un robot de pipeteado integrada qPCR ayuda enormemente con este tema, pero es una herramienta de lujo. Como con cualquier experimento, los controles adecuados y apropiados de inclusión son de suma importancia para el desarrollo de ensayos moleculares robustos, especialmente en laboratorios de diagnóstico donde tales ensayos tienen que estar acreditados. Deben incluir controles positivos (muestras positivas TiLV, TiLV plásmido estándar) y controles negativos (NTC y -RT) muestras así como la detección de genes housekeeping de tilapia endógena. Estos controles no se puede subestimar y se deben incluir en cada ensayo para entender adecuadamente la calidad de cada paso del análisis y a interpretar adecuadamente los resultados.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Instituto de bacteriología veterinaria, Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna por su apoyo. Este trabajo fue financiado por el Comité de promoción académica de investigadores de carrera temprana y equidad de género en la Facultad Vetsuisse, Universidad de Berna por 120% modelo financiación otorgada a PN. WS y PR son apoyados por el centro de estudios avanzados para la agricultura y alimentación, Instituto de estudios avanzados, Universidad de Kasetsart, Bangkok, Tailandia en la promoción de la investigación universitaria y nacional investigación Universidad proyecto de Tailandia, oficina de la educación superior Comisión, Ministerio de Educación de Tailandia. Nos gustaría agradecer al Dr. Kwanrawee Sirikanchana para su narración y Piyawatchara Sikarin para editar el video.
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |