该协议使用 rt-pcr 方法诊断罗非鱼组织中的罗非鱼病毒 (tilv)。整个方法描述了从组织解剖到总 rna 提取, 然后是 cdna 合成和检测 tilv 的常规 pcr 或定量 pcr 使用 dsdna 结合染料。
该方法的目的是促进罗非鱼湖病毒 (tlev) 在罗非鱼组织中的快速、灵敏和特异性检测。该协议可作为监测方案、生物安保措施和 tlv 基础研究实验室的一部分使用。病毒诊断的黄金标准通常涉及病毒分离, 然后是补充技术, 如逆转录酶链反应 (rt-pcr), 以供进一步验证。这可能是繁琐的, 耗时的, 通常需要组织样本严重感染病毒。rt-定量 (q) pcr 在病毒检测中的应用具有定量、灵敏度高、特异性强、可扩展性快、可快速的特点, 具有较高的检测效果。本文介绍了基于 pcr 的 tilv 检测方法的全方法, 从罗非鱼器官切片、使用包那氰化物-苯酚-氯仿溶液提取总核糖核酸 (rna)、rna 定量, 然后是两步 pcr协议, 包括补充脱氧核糖核酸 (cdna) 合成和检测 tlv 的常规 pcr 或定量鉴定通过 qpcr 绿色 i 染料。传统的 pcr 需要 pcr 后的步骤, 只需告知病毒的存在。后一种方法将允许对 tilv 进行绝对定量, 使其减少到2个副本, 因此对亚临床病例中的 tilv 诊断特别有用。对两种 pcr 方法的详细说明、两个实验室的代表性结果以及对这两种方法的关键参数的深入讨论, 都包括在内, 以确保研究人员和诊断人员找到最适合和最适用的方法tilv 检测方法。
2014年, 全球人均鱼类供应量达到20公斤的新纪录, 这是因为水产养殖强劲增长。水产养殖仍然是全世界增长最快的动物食品生产部门之一, 也是唯一增长快于人类的动物食品生产部门1。tilapiine cichilds 是全世界养殖的第二大淡水鱼, 全球总产量为640万吨, 2015年估计价值98亿美元 2.罗非鱼产量最大的十大生产国是中国 (1.78 吨)、印度尼西亚 (1.78 吨) 和埃及 (0.88 吨), 其次是孟加拉国、越南、菲律宾、巴西、泰国、哥伦比亚和乌干达.预计到 2030年, 全球罗非鱼产量将在7.3 吨左右.罗非鱼已成为如此重要的全球食物来源, 不仅因为它们是一种廉价的蛋白质来源 4, 而且还因为它们在广泛的水和气候条件下很容易繁殖 5,6。就在几十年前, 人们认为, 威胁罗非鱼养殖的具有商业意义的疾病很少, 但这已经不是事实了。一种新出现的病毒性疾病叫罗非鱼湖病毒病 (tilvd), 是罗非鱼有史以来发现的首例严重疾病流行, 整个行业都面临风险。这一疾病造成严重的社会经济后果, 对非洲7、亚洲和南美洲数百万人的粮食安全构成直接威胁。2018年初, 世界动物卫生组织 (动物卫生组织) 报告说, 在八大洲8个国家正式发现了这种疾病的病原药 tilv, 自这张病原体信息卡以来 ,更新有更多的报告, tilv 在坦桑尼亚, 乌干达9, 印度尼西亚10, 台湾11和秘鲁12.tilv 是一种新型的单链 rna 病毒, 被描述为类似正霉菌的病毒, 因为它包含各种特征, 让人想起其他正生瘤病毒, 如流感或传染性三文鱼-贫血病毒 (isav)13。它最早是在以色列加利利14湖野生和养殖罗非鱼大规模损失后确定的.此后, 埃及15例尼罗河罗非鱼和尼罗河和红色杂交罗非鱼报告了类似的疾病爆发, 称为夏季死亡和与 tilv 感染有关的一个月死亡率综合征(奥雷诺克利斯)分别在泰国16。水生动物病毒的检测历史上是通过细胞培养中病毒的生长和分离来进行的。对不同的细胞系进行了 tilv 的繁殖和分离测试, 其中包括来自奥雷奥科勒克利斯的17、18、omb 和 tmb 中提取的 e-11 细胞 。蚊子 18岁, 翁布和翁拉原产于尼罗河罗非鱼 (o. niloticus)19。虽然病毒培养的优点是它为进一步的实验提供了材料, 但它的缺点是, 它至少需要4-7 的时间来观察细胞病理效应 (cpe) 的形成, 关键是不同的鱼氨酸病毒, 这些病毒更适合复制可能会传播, 并产生类似的 cpe。
在过去的几十年里, 已经从传统的、往往耗时的诊断方法, 如细胞培养、血清学和抗原检测, 并替换为更快和更敏感的核酸检测测试20, 21岁这一点是显而易见的, 许多 qpcr 检测已开发成为重要的诊断方法, 在水生动物的多种病毒性疾病, 如 isav22,23, 病毒出血性败血症病毒 (vhsv)24 , 25, β-病毒26,27沙粒甲型六病毒 28, 鱼虹膜病毒29, 安吉利德疱疹病毒 1 (anghv1) 30, 和淋巴细胞疾病病毒 (lcdv)31.迫切需要可靠的诊断和病原体监测方法, 以减少 tilv 的传播。这种方法应允许在临床体征发展之前及早发现感染, 并检测低病毒负荷。迄今为止, 已经开发了不同的 pcr协议,包括 rt-pcr 14、32、嵌套 rt-pcr18、半嵌套的 rt-pcr 33 和 rt-qpcr32、34, 用于检测 tilv在鱼组织中。通过对用于 tilv 检测的易感细胞系中的 rt-qpcr 和病毒分离的比较, 发现 rt-qpcr 的敏感性是病毒分离32 的 1, 000倍。尽管每个已发布的 pcr 协议都报告了对 tilv 检测的不同敏感性, 但大多数检测方法都具有高度敏感性, 病毒拷贝的检测限值为 7.5份, 样本份为 33, 7 份为 18 或2份拷贝, 每份 32份反应。
本文的目的是详细解释如何进行 tilv 检测检测, 从罗非鱼组织采集开始, 到总 rna 提取、cdna 合成, 再到 tilv 特异性 pcr 检测。具体而言, 已经描述了常规 rt-pcr 和 sybr 绿色的 rt-qpcr 的综合协议, 以吸引广泛的科学家, 旨在检测 tilv。前者不太敏感, 但通常是一种更便宜的检测选项。后者需要更精细的基础设施, 如定量 pcr 机器和更昂贵的试剂, 但它的优点是定量、快速和高度敏感, 这意味着它可用于亚临床检测 tilv受感染的鱼。rt-pcr 和 rt-qpcr 协议是在两个不同的实验室进行的, 这些实验室具有不同的地理分离株 tilv, 其中的结果突出了这里描述的检测的敏感性和重现性。
tilv 于2014年首次在以色列报告,自那时以来, 已在多个国家发现, 包括埃及、哥伦比亚、印度、马来西亚、乌干达、坦桑尼亚和泰国15、16、18、35,48. 全球认识, 特别是罗非鱼生产国的认识, 更加关注该病毒, 政府当局实施了各种限制和控制措施, 试图防止 tilv 的传播。本文详细介绍了罗非鱼组织中的 tilv 检测方案, 包括样本采集、rna 分离、cdna 合成、pcr 和 qpcr 检测。这些方法有各个方面值得具体讨论。到目前为止, 在大小为 9、12、14、15、49的鱼类中已经发现了 tilv 和罗非鱼品种, 包括养殖的杂交罗非鱼(o. o。11,14, 尼罗河罗非鱼 ( o. niloticus)9,10, 14, 15, 16,33,35,36,49,50和红色罗非鱼 (oro虫夏子sp.)16,33,48, 51,以及在野生尼罗河罗非鱼9,12, 黑色罗非鱼51, t. zilli14,15, s.galilaeus, o. aureus 和 t. simonis中间体 14 , 最近在野生鲤鱼 (barbonyus) 中发现了 tilv斯瓦南费迪)52。来自内脏器官 (刺、脾、肝、心、头肾) 或粘液37的组织样本可以从健康和垂死的罗非鱼中采集, 而不论其年龄、大小或物种如何, 并进行 rna 分离处理。这里概述的总 rna 提取协议使用苯酚和硫氰酸 guanidinium 的单相溶液, 它是一种各向异性变性剂。组织在这种溶液中直接同质化, 然后加入氯仿和离心, 以实现相分离, 其中含有上水相、间相和较低的有机相的透明 rna。通过异丙醇沉淀法从水相中分离 rna, 然后清洗回收的 rna 以去除污染物。采用这种方法分离 rna 是由 piotr chomczynski 和 nicoletta sacchi 首创的, 被称为 guanidinium 硫氰酸酯-苯酚-氯仿提取物53,54。这种类型的试剂用于 rna 提取可以商业购买或在实验室制造 (见材料表的进一步信息)。与硅基纯化等柱基方法相比, 该协议所需的时间稍长, 但一般来说, 它更具成本效益, 产生更多的 rna。
在该协议中, 概述了使用 a260 值定量 rna 的方法, 即分光光度法值可以指示 rna 质量 (a260\ a280 = 1.9-2.1)。虽然这种方法将提供一个很好的样品纯度的指示, 它不能绝对告知提取的 rna 的质量。为了正确地确定 rRNA 是否完整或部分降解, 样品可以通过琼脂糖凝胶电泳分离, 其中 etbr 染色18s 和 28s rrna 带的涂抹表明 rRNA 降解。rna 质量的进一步验证可能包括使用片上实验室仪器。此外, 用 dnase i 消化纯化的 rna 以去除污染宿主基因组 dna 也很重要, 这取决于下游应用可能会导致错误的结果。如果宿主 gdna 仍在很大程度上污染 rna 样品, 也可以在 rna 提取过程结束时进行额外的 dnasei 处理 (见材料表)。
互补 dna 合成可以极大地影响整个 qpcr 结果, 是该方法的一个方面, 可以引入变异。这里提倡的 cdna 协议包括使用寡核苷酸 (dt) 的单个组件设置, 因此只转录含有多 a 尾的 mrna。它允许用户控制在逆转录酶中究竟使用哪些成分, 这种 cdna 合成模式已被证明是成功的 tilv 检测 32.这种设置的另一种选择是商业购买的主混料, 其中包含逆转录酶反应所需的所有组件, 并且非常快速和简单, 无需通常的多步骤、移液和多温度协议。这是有利的, 因为它最大限度地减少了处理, 并促进了所有样品的一致性。这种主混物通常包括寡核苷酸 (dt) 和随机引物, 使其适用于不同的 rna 模板, 并从种群中的整个 rna 长度 (病毒和罗非鱼宿主 mrna) 生成具有代表性的 cdna 序列副本, 理论上,然后, 可以通过常规 pcr 或 qpcr 从这样的样本中测量每个所需的 rna 物种。这种多功能性是两步 rt-pcr 方法的主要优点;它提供了一个长期的池, 可以用于许多不同的实验。结果表明, 采用了一步 rt-pcr 方法, 其中使用了序列特异性引物 (表 1), 并在一个管中进行了 rt 和 pcr (见材料清单)。一般来说, 序列特定引物比使用随机启动更高的特定目标 rna rna rt 效率, 但特定目标 rna 是唯一可以在这样的 cdna 样本中量化的, 而这可能是某些实验室的唯一目的 (见cdna 合成产品的材料表)。
虽然到目前为止, 常规的 rt-pcr 似乎在 tilv 诊断中普遍使用,13,14,15,16,17, 18,33,35,48,55. rt-qpcr 已被证明是检测和定量鱼类组织或粘液中少量 tilv 的更有力工具 32、37。qpcr 以其灵敏度高、特异性强、重现性好、动态范围宽、速度21等优点, 在临床病毒学诊断实验室中得到了广泛的应用。虽然 qpcr 最初的实施成本可能高于传统的 rt-pcr, 但与传统的 pcr 相比, 它确实提供了许多重要的优势;它具有更快的周转时间从样品到结果, 它不需要任何 pcr 后步骤。后一点意味着实验室污染的风险最小, 它可以更容易地适应高通量的情况, 例如在爆发的情况下。此外, 它本质上比传统的 rt-pcr 更敏感, 它对于检测亚临床感染21中的低病毒载量至关重要。这将需要一个嵌套的 pcr 方法, 需要逆转录酶链转录, 两个进一步的 pcr 反应, 然后通过琼脂糖凝胶电泳分析。这些许多步骤需要大量的时间, 并增加错误或污染的机会。尽管如此, 由于其高灵敏度, rt-qpcr 要求细致的实验设计和对定量技术的透彻理解, 以产生精确的结果56,57。
该协议演示了 dna 结合荧光体 sybr green i。它是一种 dsdna 非特异性 dna 结合染料, 因此该检测的特异性完全在于引物集, 这可能会产生假阳性58。因此, 虽然在每次 pcr 结束时进行的 dsdna 熔融曲线分析是 pcr 反应的一个特别重要的部分, 因为它证实只产生了一个正确的 t m pcr 放大器 (这也应该通过凝胶来实现)在实施新的检测时进行电泳)。dna 片段的 tm 取决于多种特征, 如长度、气相色谱组成、序列、链互补、浓度以及缓冲成分和 pcr 增强剂。两个实验室在有代表性的结果中进行的熔融曲线分析没有发现初级二聚体或其他不需要的 pcr 产物的存在, 但如果用其他样品和实验装置观察到这一点, 那么检测结果应该是重新优化。更先进的 qpcr 技术不需要这样的熔融曲线步骤, 事实上, 自从编写了这篇论文以来, 利用两个引物和一个探针开发了一个基于 taqman 的 tilv rt-qpcr, 使其具有高度的 tilv 特异性34。
毫无疑问, 为 rt-qpcr 检测设计的引物是检测成功的基础, 这里的引物是根据当时公开的 tilv 基因组数据设计的。然而, rna 病毒是众所周知的表现出很高的突变率和可能的菌株将逃脱目前的诊断测试, 正如观察到 isav59.这类病毒类型将始终难以生成通用的泛 tilv rt-qpcr 检测方法, 只有在有更多来自影响深远的位置和时间段的 tilv 基因组数据可用的情况下, 此类检测才会不断得到改进。
最后, 在 qpcr 内和 qpcr 内检测中进行重复的或在可能的情况下运行三文三联反应是非常重要的。如果 ct 值非常高, 则使用复制物对于确保 pcr 反应是可靠和可重现的尤为重要。一般情况下, 如果复制反应的数据变化超过0.5个周期, 则应重复反应, 如果复制中的 ct 值持续变化 & gt; 0.5个周期, 则应重新优化检测结果。使用集成的 qpcr 移液机器人对解决这个问题有很大的帮助, 但它是一个豪华的工具。与任何实验一样, 纳入适当和适当的控制对于开发强大的分子检测至关重要, 特别是在必须认可此类检测的诊断实验室。控制应包括阳性 (阳性 tilv 样本、tilv 质粒标准) 和阴性对照 (ntc 和-rt) 样本, 以及内源性罗非鱼内务基因的检测。这种控制不可低估, 应包括在每个检测中, 以正确理解每个步骤的质量, 并正确解释结果。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢伯尔尼大学 vetsuisse 学院兽医细菌学研究所的支持。这项工作由伯尔尼大学威特苏塞学院早期职业研究人员和两性平等学术促进委员会资助, 向 pn 提供了120% 的示范资金。ws 和 pr 由泰国曼谷 kasetsart 大学农业和粮食高级研究中心、高级研究所、泰国高等教育研究促进和国家研究大学项目提供支持, 办公室泰国教育部高等教育委员会主席。我们要感谢 kwanrawee sirikanchana 博士的叙述和 piyawatchara sikarin 编辑的视频。
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |