이 프로토콜 tilapia 조직 RT PCR 방법론을 사용 하 여에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)를 진단 한다. 전체 메서드 총 RNA 추출, cDNA 합성 및 기존의 PCR 또는 양이 많은 PCR dsDNA 염료를 형광 바인딩 바인딩을 사용 하 여 TiLV의 탐지를 조직 해 부에서 설명 되어 있습니다.
이 방법의 목표 tilapia 조직에 Tilapia 호수 바이러스 (TiLV)의 빠르고, 과민 하 고 특정 검색을 용이 하 게 하는 것입니다. 이 프로토콜의 일부로 감시 프로그램, 생물 측정 그리고 TiLV 기초 연구 실험실에서 사용할 수 있습니다. 바이러스 진단의 황금 표준 일반적으로 바이러스 격리를 리버스 전사 연쇄 반응 (RT-PCR) 추가 확인 등 보완 기술 다음을 포함 한다. 이 성가신, 시간이 많이 소요 될 수 있습니다 하며 일반적으로 무 겁 게 바이러스에 감염 된 조직 샘플. RT-양적 (q) PCR 바이러스의 검출에의 사용 그것의 양적 성격, 높은 감도, 특이성, 확장성 및 결과에 그것의 급속 한 시간 때문에 유리 하다. PCR의 전체 방법 탐지는 tilapia 기관 단면, 총 ribonucleic 산 (RNA) 추출에서 guanidium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션, RNA 정량화, 뒤에 2 단계 PCR를 사용 하 여 설명 하는 TiLV에 대 한 접근을 기반으로 여기, 프로토콜을 수 반하는, 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA) 합성 및 기존의 PCR 또는 양적 식별을 통해 정량 SYBR 녹색을 사용 하 여 TiLV의 감지 나 염료. 기존의 PCR PCR 게시물 단계 필요 하 고 단순히 바이러스의 존재에 대해 알릴 것 이다. 후자의 접근 방식을 조금 2 부 다운 TiLV의 절대 정량화에 대 한 고 따라서 하위 임상의 경우에서 TiLV 진단에 매우 유용. 두 개의 PCR 방법, 2 개의 실험실에서 대표 결과 대 한 자세한 설명 및 둘 다의 중요 한 매개 변수에 대 한 철저 한 토론 연구자와 diagnosticians 그들의 가장 적합 하 고 해당 찾을 수 있도록 포함 되었습니다. TiLV 검출의 방법입니다.
글로벌 1 인당 물고기 공급 2014 년에서 20 kg의 새로운 기록을 도달 하 고 이것은 양식 업에 활발 한 성장 때문. 양식 전세계 급성장 동물 식품 생산 부문 중 하나 이며 인구1보다 더 빨리 성장 하 고 유일한 동물 식품 생산 부문. Tilapiine cichilds 6.4 백만 톤 (MT)의 총 세계 생산 및 201529.8 십억 미국 달러의 추정된 가치 전세계 농장 2 차로 가장 중요 한 민물 생선으로 구성 됩니다. Tilapia의 톱 10 생산자는 중국 (1.78 MT), 인도네시아 (1.12 MT)와 이집트 (0.88 MT), 방글라데시, 베트남, 필리핀, 브라질, 태국, 콜롬비아, 우간다2뒤. 글로벌 tilapia 생산 약 7.3 될 것으로 예상 된다 20303몬태나. 뿐만 아니라 단백질4 의 저렴 한 소스 뿐만 아니라 때문에 그들은 물과 기후 조건5,6의 다양 한 범위에서 용량에 번 식 하기 쉽기 때문에 tilapia 같은 중요 한 글로벌 식품 소스 되고있다. 그냥 몇 년 전, 몇 가지 상업적으로 중요 한 질병 tilapia 농업을 위협 했지만이 사실이 더 이상 믿어 졌다. Tilapia 호수 바이러스 질환 (TiLVD) 이라고 하는 신흥 바이러스 성 질병은 첫번째 이제까지 중요 한 질병 전염병 tilapia에서 발견 하 고 전체 산업은 위험에. 이 질병은 심각한 사회 경제적 결과 이며 아시아와 남미 아프리카7, 사람들의 수백만 위한 식량 안보에 직접적인 위협. 2018의 시작, 동물 건강 (OIE)에 대 한 세계 기구 보고 8 국가8 를 다루는 3 개의 대륙에 그리고이 병원 체 정보 카드는 TiLV,이 질병의 etiological 대리인 공식적으로 발견 되었습니다 했다 거기 업데이트 우간다9, 인도네시아10, 대만11 및 페루12탄자니아에 TiLV의 더 보고 되었습니다. TiLV은 다양 한 연상 독감 이나 전염 성 연어 빈혈증 바이러스 (ISAV)13등 다른 orthomyoxoviruses 특성을 포함 하기 때문에 orthomyxo 같은 바이러스를 되도록 설명 소설 단일 가닥 RNA 바이러스. 그것은 먼저 갈릴리 호수, 이스라엘14야생 및 농장 tilapia의 대규모 손실의 여파에 확인 되었다. 그 후, 비슷한 질병 발생 추천 여름 mortalities 및 TiLV 감염 연관 사망률 증후군 나 일 틸 라 피아 (Oreochromis niloticus) 이집트15 에 나 일에 빨간색 하이브리드 tilapia 보도 했다 한 달 (Oreochromis 종) 태국16, 각각. 수생 동물 바이러스의 검출은 역사적으로 성장 및 세포 배양에서 바이러스의 분리에 의해 수행 됩니다. 다양 한 셀 라인 전파 및 TiLV 포함, E-11 셀 독 사 물고기 (Ophiocephalus striatus)17,18에서 파생 된 OmB Oreochromis 에서 발생 하는 TmB의 격리에 대 한 테스트 mossambicus18, OnlB 및 OnlL 나 일 틸 라 피아 (O. niloticus)19에서 발생. 바이러스 문화는 추가 실험에 대 한 자료를 제공 한다는 이점이 있다, 그러나 그것은 cytopathic 효과 (CPE)의 형성을 관찰 하기 위해 적어도 4-7 일을 요구 하 고 결정적인 다른 시세 바이러스는 더 적합 하는 단점이 있다 복제는 전파 될 수 있습니다 하 고 유사한 CPE 생산.
지난 몇 십년에 세포 배양, 혈 청 학 및 항 원 탐지 및 신속 하 고 더 민감한 핵 산 기반 탐지 테스트20, 교체 등 전통, 수시로 시간이 걸리는 진단 방법 멀리 이동이 되었습니다. 21. 이것은 많은 정량 분석 실험 개발 되었습니다 다양 한 수생 동물의 바이러스 성 질병에 대 한 중요 한 진단 방법으로와 같은 ISAV22,23, 바이러스 haemorrhagic septicaemia 바이러스 (VHSV)24에 대 한 사실에 의해 분명 하다 ,25, betanodavirus26,27 salmonid alphavirus28, 물고기 iridovirus29, Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)30및 Lymphocystis 질병 바이러스 (LCDV)31 . 진단 및 병원 체 감시에 대 한 강력한 방법 긴급 TiLV의 확산을 줄일 필요가 있습니다. 이러한 방법을 임상 증상을 개발 하기 전에 감염의 조기 발견 및 낮은 바이러스 부하의 검출을 허용 해야 합니다. 날짜 하려면, RT-PCR14,32를 포함 하 여 다른 PCR 프로토콜 중첩된 RT-PCR18, 세미 중첩된 RT-PCR33, 그리고 실시간 정량32,34 개발 되었습니다 TiLV의 검출에 대 한 물고기의 조직에서 TiLV 검색 취약 셀 라인에서 실시간 정량 및 바이러스 격리의 비교 계시 실시간 정량 바이러스 격리32보다 1000 배 더 과민 했다. 각 게시 된 PCR 프로토콜은 TiLV의 검출을 위한 다른 감도 보고, 대부분 분석 매우 민감한 7.5 복사본33, 7 복사본18 또는 당 2 부32 바이러스의 검출 한계는 반응입니다.
이 방법 문서의 목표는, 자세히, tilapia 조직 컬렉션, 총 RNA 추출, cDNA 합성 시작 TiLV 탐지 분석 실험을 수행 하는 방법을 설명 하 고 TiLV 특정 PCR 분석 실험을 기반으로. 특히, 기존의 RT-PCR와 또한 SYBR 녹색 기반 실시간 정량의 포괄적인 프로토콜 TiLV를 감지 하는 것을 목표로 하는 과학자의 넓은 범위에 호소를 설명 있다. 전 덜 민감 하지만 일반적으로 더 싼 검색 옵션. 후자 정량 PCR 기계 등 더 비싼 시 약, 더 정교한 인프라를 필요로 하지만 그것은 양적, 신속 하 고 매우 중요 한, 그것은 사용할 수 있는 TiLV에서의 검출에 대 한 하위 임상 의미의 이점이 있다 물고기를 감염. RT-PCR 및 RT-정량 Pcr 프로토콜 TiLV 및 포함된 결과 강조 감도의 명료한 지리적 격리와 여기에서 설명 하는 분석 실험의 재현성 두 다른 실험실에서 수행 했다.
TiLV 이스라엘14 2014에 처음 알려졌다 고 그 이후로, 그것은 이집트, 콜롬비아, 인도, 말레이시아, 우간다, 탄자니아, 태국15,,1618, 를 포함 한 여러 나라에서 발견 되었습니다. 35 , 48. 세계 인식, 특히, tilapia 생산 국가에 더 많은 관심에 배치 바이러스 및 다양 한 제한 및 정부 기관에서 대책 시도 TiLV의 확산을 방지 하기 위해 구현 되었습니다. 여기, tilapia 조직, 샘플 수집, RNA 격리, cDNA 합성, PCR과 정량 분석 실험에서에서 TiLV 검색에 대 한 상세한 프로토콜 설명 되었습니다. 특정 토론을 보증 하는 경우 이러한 방법에 다양 한 측면을 확인 하 고 있습니다. TiLV는 물고기는 다양 한 크기9,12,,1415,49 와 지금까지 농장된 하이브리드 tilapia (o.를 포함 한 tilapia의 종에서 발견 되었습니다. 오 균 x niloticus)11,14, 나 일 틸 라 피아 (O. niloticus)9,10,,1415,16, 33 , 35 , 36 , 49 , 50 와 붉은 틸 라 피아 (Oreochromis sp.)16,33,,4851, 뿐만 아니라 야생 나 일 틸 라 피아9,12, 블랙으로 tilapia51, T. zilli14,15, S. galilaeus, 오 균 과 T. simonis intermedia14 그리고 아주 최근에 TiLV 야생 잉어 (Barbonymus에서에서 확인 된 schwanenfeldii)52. 내부 장기 (길, 비장, 간, 심장, 머리 신장) 또는 점액37 에서 조직 샘플 나이, 크기 또는 종에 건강으로 죽어가는 tilapia에서 수집 하 고 RNA 격리에 대 한 처리 수 있습니다. 설명 된 총 RNA 추출 프로토콜 여기 chaotropic 변성 에이전트를은 페 놀 및 guanidinium 안산의 monophasic 솔루션을 사용 합니다. 조직에는 클로 프롬 및 위 수성 단계는 interphase, 낮은 유기 단계를 포함 하는 분명 RNA 생성 되는 어떤 점에서 단계 분리를 달성 하기 위해 원심 분리의 추가 의해 다음이 솔루션에 직접 무 균. RNA는 소 프로 파 놀 강 수, 오염 물질의 제거에 복구 된 RNA의 세척에 의해 다음에 의해 수성 단계에서 격리 됩니다. 이 방법론에 의해 RNA의 격리 Piotr Chomczynski와 니콜 Sacchi에 의해 개척 되었다 고 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출53,54로 불렸다. 사용할 RNA 추출 시 약의이 종류를 상업적으로 구입한 하 또는 실험실에서 수 있습니다 (자세한 내용은 재료의 표 참조). 이 프로토콜은 실리 카 기반 정화 등 열 기반 메서드는 보다 약간 이상 하지만 일반적으로, 더 비용 효과적 이며 더 많은 RNA를 생성.
이 프로토콜에서 RNA A260 값을 사용 하 여 측정 설명 했다 분 광 광도 학 값 RNA 품질을 나타낼 수 있다 그것에 의하여 (A260/A280 = 1.9-2.1). 이 메서드는 샘플 순도의 좋은 표시를 줄 것 이다, 하는 동안 그것은 절대적으로 추출 된 RNA의 품질에 대 한 알릴 수 없습니다. 제대로 되는지 확인 하려면 RNA 그대로 또는 부분적으로 저하, 샘플 수 점에서 18S 스테인드는 EtBr의 번짐 agarose 젤 전기 이동 법으로 분리 되며 28S rRNA 밴드 RNA 저하를 나타냅니다. RNA 품질의 더 검증 랩 온 칩 악기를 사용 하 여 포함할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 DNase와 순화 된 RNA를 소화 하는 것이 중요 오염 제거 하려면 호스트 게놈 DNA를 다운스트림 응용 프로그램에 따라 잘못 된 결과가 발생할 수 있습니다. RNA 추출 절차의 끝에 추가 DNaseI 처리를 수행할 수도 있습니다 경우 호스트 gDNA 여전히 대부분 RNA 샘플을 오염 이다, ( 재료의 표참조).
보완 DNA 합성 전체 정량 결과 크게 영향을 미칠 수 있습니다 하 고 변화를 발생 시킬 수 있는 방법의 한 측면 이다. 단일 구성 요소 설정의 구성 하 고 여기에 주 창 하는 cDNA 프로토콜 올리고 (dT)를 사용 하 고 따라서만 polyA 꼬리를 포함 하는 mRNAs를 transcribes. 그것은 정확 하 게 반전 녹음 방송 반응 및 cDNA의이 모드에서 사용 하는 구성 요소의 합성은 성공적으로 입증 TiLV 탐지32에 대 한 사용자 정의 컨트롤을 수 있습니다. 이 설정 대신 포함 하는 상업적으로 구입 마스터 믹스 반전 녹음 방송 반응에 필요한 모든 구성 요소 이며 매우 신속 하 고 일반적인 다단계, pipetting 및 멀티 온도 프로토콜 없이 간단. 그것은 처리를 최소화 하 고 모든 샘플에서 균일성을 촉진 하기 때문에 이것은 유리입니다. 같은 마스터-믹스 자주 등 모두 oligo(dT) 인구에 RNAs의 전체 길이에서 시퀀스의 대표적인 cDNA 복사본을 생성 하는 다른 적용 가능한 RNA 서식 파일을 만드는 무작위 뇌관 (바이러스 및 tilapia mRNA 호스트)와 이론, 모든 원하는 RNA 종 다음 기존의 PCR 또는 이러한 샘플에서 정량으로 측정할 수 있습니다. 이 다양성은 주요 활용 2 단계 RT-PCR 접근; 그것은 많은 다른 실험에 사용할 수 있는 장기 수영장을 제공 합니다. 결과에 원스텝 RT-PCR 접근 표현 하고있다 어떤 점에서 시퀀스 특정 뇌관 (표 1) 사용 되 고 고 RT PCR 한 튜브에서 수행 했다 (소재 목록 참조). 일반적으로, 순서 특정 한 뇌관 임의의 뇌관을 사용 하 여 보다 구체적인 대상 RNA의 높은 RT 효율성에 대 한 허용 하지만 특정 대상 RNA는 유일 하 게 같은 cDNA 샘플 ( 를 참조 하는 특정 실험실의 유일한 목적은 될 수 있는 양이 정해질 수 있는 자료의 테이블 cDNA 합성 제품 제안을 위해).
그러나 기존의 RT-PCR 나타납니다 일반적으로 사용 되는 TiLV 진단9,13,14,15,,1617,18, 에서 지금까지 33 , 35 , 48 , 55. 실시간 정량 검출 및 정량화 물고기 조직 또는 점액32,37TiLV의 작은 금액에 대 한 더 강력한 도구에 표시 되었습니다. 일반적으로, 정량은 높은 감도, 특이성, 좋은 재현성, 넓은 동적 범위 및 속도21바이러스학 임상 진단 실험실에서 널리 이용 된다. 정량은 처음 기존의 RT-PCR 보다 구현 비용이 있을 수 있습니다, 그것은 많은 중요 한 이점을 기존의 PCR; 제공지 않습니다. 그것은 보다 빠른 설정-주위 시간 샘플에서 결과를 하 고 어떤 게시물-PCR는 단계를 필요 하지 않습니다. 이 후자의 포인트 실험실 오염에 대 한 최소한의 위험이 발생 시와 같은 높은 처리량 상황에 더 쉽게 적용할 수 있습니다 의미 합니다. 또한, 그것은 본질적으로 기존의 RT-PCR의 중요 한 하위 임상 감염21낮은 바이러스 부하를 감지 하는 보다 더 민감한. 이것은 중첩 된 PCR 방법은 반전 녹음 방송 필요로 해야, 두 개의 추가 PCR 반응 그리고 분석 agarose 젤 전기 이동 법. 이러한 많은 단계 시간을 많이 하 고 오류 또는 오염의 기회를 증가. 그럼에도 불구 하 고, 그것의 높은 감도 때문에 실시간 정량 세심 한 실험 설계 및 정확한 결과56,57를 생성 하기 위한 정량화 기법에 대 한 철저 한 이해를 요구 한다.
DNA 바인딩 fluorophore, SYBR 녹색 내가이 프로토콜에서 입증 되었습니다. 난다 DNA 바인딩 dsDNA 염료 이며 따라서 분석 결과의 특이성 뇌관, 가양성58를 생성할 수 있습니다 집합에 완전히 거짓말. 따라서, 녹는 곡선 분석 끝에 각 PCR 수행 dsDNA PCR 반응의 특히 중요 한 부분 이므로 그 하나만 PCR amplicon 올바른 T의 확인 하는 동안m 생산 (이 또한 의해 달성 되어야 젤 전기 이동 법 새로운 분석 구현 되는 경우). DNA 파편의 Tm 다양 한 길이, GC 구성, 시퀀스, 스트랜드 complementarity 기능에 따라 달라 집니다, 그리고에 뿐만 아니라 집중 버퍼 구성 요소 및 PCR 강화. 실험실 뇌관 이합체 또는 다른 원치 않는 PCR 제품의 존재를 공개 하지 않았다 그러나 경우이 다른 샘플 및 실험적인 체제과 관찰, 분석 결과 이어야 한다 2에서 표시 된 대표 결과에 녹는 곡선 분석 다시 최적화. 고급 정량 기술 같은 녹는 곡선 단계를 필요로 하지 않는 하 고 실제로, 종이 작성 되었습니다이 방법을 기반으로 TaqMan부터 TiLV RT-정량 개발 되었습니다 2 개의 뇌관 및 높은 TiLV 특정34만들기 검색을 활용 하 여.
의심의 여지가, 실시간 정량 Pcr 분석 실험을 위한 뇌관 분석 결과의 성공에 필수적 이며 여기에 뇌관32시간 공개적으로 사용 가능한 TiLV 게놈 데이터에 따라 설계 되었습니다. 그러나, RNA 바이러스는 잘 알려진 높은 돌연변이 비율을 전시 하 고 가능한 긴장 ISAV59에 대 한 관찰로 현재 진단 테스트를 탈출 한다. 그것은 어려울 것 이다 항상 보편적인 팬-TiLV RT 생성 하와 같은 바이러스 종류-정량 분석 결과 같은 분석 실험만 지속적으로 향상 됩니다 광범위 한 위치 및 시간 기간에서 더 많은 TiLV 게놈 데이터를 사용할 수 있게 하는 경우.
마지막으로, 중복 실행 또는 가능 하다 면, 둘 다 내부에서 반응 triplicate 인터 정량 분석 실험을 필수적 이다. Ct 값이 매우 높은 경우, 복제의 사용은 특히 PCR 반응 안정적이 고 재현 가능한가 확인 하는 것이 중요. 일반적으로 데이터를 복제 하는 경우 반응 다릅니다 이상 0.5 사이클, 반응과 반복 해야 경우 Ct 값 > 0.5 사이클에서 일관 되 게 복제, 분석 결과 다시 최적화 해야 합니다. 통합된 정량 pipetting 로봇의 사용은 대단히이 문제와 도움이 됩니다 하지만 그것은 고급 도구입니다. 어떤 실험을 포함 한 적절 하 고 적절 한 컨트롤으로 이러한 분석 실험 인가 해야 진단 실험실에서 특히 강력한 분자 분석 실험의 발달에 매우 중요입니다. 컨트롤 내 생 tilapia 하우스키핑 유전자의 검출 뿐만 아니라 포지티브 (긍정적인 TiLV 샘플, 표준 TiLV 플라스 미드)와 부정적인 컨트롤 (NTC와-RT) 샘플을 포함 해야 합니다. 이러한 통제 과소평가 될 수 없다 고 제대로 각 단계 분석 결과의 품질을 이해 하 고 제대로 결과 해석 하는 각 분석 결과에 포함 되어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 그들의 지원에 대 한 수의 세균 학 연구소, Vetsuisse 교수, 베른 대학에 감사입니다. 이 작품은 pn 수 여 Vetsuisse 교수, 120% 모델 자금에 의해 베른 대학에서 초기 경력 연구원의 학술 진흥 및 성 평등을 위한 위원회에 의해 투자 되었다. WS 및 홍보는에서 지원 센터 고급 연구를 위한 농업 및 식품, 고급 연구, Kasetsart 대학, 방콕, 태국 등 교육 연구 진흥 및 국가 연구 대학 프로젝트의 태국, 오피스 연구소 고 등 교육 위원회, 교육 과학기술부, 태국. 우리는 그녀의 내레이션에 대 한 박사 Kwanrawee Sirikanchana Piyawatchara Sikarin 비디오 편집을 위한 감사 하 고 싶습니다.
Tissue collection | Step 1 | ||
Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
RNA extraction | Step 2 | ||
TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
cDNA synthesis | Step 4 | ||
Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
PCR | Step 5 | ||
DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
– Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
– GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
– Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
– Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
– Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
– Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
qPCR | Step 6 | ||
PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
Equipment | |||
Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
General Materials | |||
Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |