Rekombinant Adeno ilişkili virüs yetişkin farelerde doğrudan intratekal enjeksiyon
Summary
Burada %1 lidokain hidroklorür viral bir çözümde küçük hayvanlar için verimli adeno ilişkili virüs teslim edilmesini sağlamak ve iletim verimliliği merkezi tahmin etmek için bir skorlama sistemi kurmak için bir doğrudan intratekal enjeksiyon tekniği mevcut sinir sistemi geçici zayıflık lidokain tarafından indüklenen derecesine göre.
Abstract
İntratekal (BT) enjeksiyon adeno ilişkili virüs (AAV) içinde CNS CNS gen terapisi Emanet, noninvasiveness ve mükemmel iletim etkinliği sayesinde önemli ilgi çekmiş olmalı. Önceki çalışmalarda AAV teslim gen terapisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi potens tarafından yönetim gösterdi. Ancak, öngörülemeyen hatası BT yönetim küçük hayvanlarda teknik sınırlandırılması nedeniyle yüksek oranlarda bildirilmiştir. Burada, %1 lidokain hidroklorür enjeksiyonu çözüm içine ekleyerek lumbar ponksiyon küçük hayvanlarda başarı kapsamını belirtmek için bir skorlama sistemi kurduk. Biz daha fazla geçici zayıflık enjeksiyon takip ölçüde AAV iletim verimliliği tahmin edebilirsiniz göstereceğim. Böylece, BT ekleme Buyöntem fare modelleri MSS geniş bölgelerinde eziyet CNS hastalıkları tedavi edici çalışmalarda en iyi duruma getirmek için kullanılabilir.
Introduction
AAV CNS iletim birkaç yan etkisi ile uzun vadeli ve yaygın gen ifadesinde aracılık ve bu nedenle amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington’ın da dahil olmak üzere CNS hastalıkları tedavi etmek gen tedavisi için en umut verici araçlar haline gelmiştir hastalığı (HD), Alzheimer hastalığı (Ah), lizozomal hastalıklar (LSD), Gaucher hastalığı (GD) ve nöronal ceroid lipofuscinosis (NCL)1. Halen, 100’den fazla AAV serotipleri insan ve hayvan izole edilmiştir. Bunlar arasında en az 12 içinde Preklinik kullanılmıştır ve en çok da dahil olmak üzere klinik çalışmalarda kullanılan gen vektörel çizimler gibi AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 ve rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Farklı CNS hastalıkları nedeniyle çeşitli etkilenen CNS bölgeler ve hücre tipleri farklı AAV teslim stratejileri gerektirir. CNS bölgeler ve hücre AAV transduce türleri değişir bağlı olarak serotip yanı sıra teslimat yöntemi. Örneğin, rAAVrh10 nöronlar ve ne zaman intratekal enjeksiyon4,7tarafından teslim glia transduced ise ağırlıklı olarak sistemik damar içi enjeksiyon (IV), tarafından teslim astrocytes transduce gösterilmiştir. İntraventriküler aracılığıyla beyin-omurilik sıvısı (BOS) içine enjeksiyon veya intratekal enjeksiyon yaygın CNS iletim8 sonuçlandı, ancak buna ek olarak, parankimi enjeksiyon enjeksiyon yeri çevresinde için yerel iletim sonuçlandı . Çalışmalar de AAV teslim gen tedavisi nörodejeneratif hastalıklarda tedavi edici etki gücü tarafından Yönetim9,10,11göstermiştir. CNS ALS gibi geniş alanlarda etkileyen hastalıklarda intratekal enjeksiyon bos içine bir sistemik teslim Yöntem4,10‘ a kıyasla daha düşük bir dozda hastalıkla tarafından tutulmuş çoğu alanları kapsayacak şekilde gösterilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda da bu lomber ponksiyon laminektomi ve intratekal kateterizasyon4ile ilişkili olası yaralanmaları önler ALS için fare modellerinde AAV enjekte için kullanılan göstermiştir.
Deneysel doğrudan lumbar ponksiyon ilk ajanlar, özellikle anestezi, spinal kord analjezi ve anestezi 188512,13için teslim etmek için kullanılmıştır. Bu raporda, lomber ponksiyon BT enjeksiyon yöntemi %1 lidokain hidroklorür, bir yerel Amid kaynaklı anestezi, değerlendirmek ve enjeksiyon kalite izlemek için enjeksiyon çözümde yardımı ile yetişkin farelerde göstermektedir. Başarısız olan iğneleri bu davranışı belli etmedi, ancak başarılı enjeksiyonları lidokain kaynaklı geçici felç tarafından işaretlenen. Enjeksiyon verimliliği tahmin yardımcı olmak için beş sınıflarda biri olarak geçici zayıflık düzeyini gizli. Son olarak, biz rAAVrh10 iletim düzeyi felç sınıf tarafından tahmin edilebilir gösterir. Bu nedenle, bu kulaklıklar AAV teslim yöntemi AAV aracılı gen-teslimat için deneysel tedavi CNS hastalıkları geliştirmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teknik olarak, uyanık farelerde BT enjeksiyon sırasında birkaç önemli adımlar vardır. İlk, uygun jest ve firma denetimi tüm operasyon boyunca farelerin başarılı teslimat için bir ön koşul olduğunu. İkinci olarak, değil çok fazla direniş olmadan eklemek veya zorla hayvanlar yaralanmasına veya iğne ucunu bükme durumunda güçlü direnç altında eklemek için gerekli olduğu gibi en zor nokta intervertebral alanı iğne ucu ile hissediyor. Üçüncü olarak, lidokain nedeniyle geçici felç objektif …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser HEBEI İl Müdürlüğü insan kaynakları ve sosyal güvenlik (CY201605) hibe ve Hebei Eyaleti, Doğa Bilimleri Vakfı (H2017206101) bir hibe tarafından finanse edildi, ve biz AAV için sağlanan Guangping Gao için Dr için çok minnettarız Bu çalışmada.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
- Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76 (2014).
- Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).
- Yang, B., et al. Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10. Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).
- Guo, Y., et al. A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).
- Hastie, E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success–a personal perspective. Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).
- Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases. Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).
- Tanguy, Y., et al. Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36 (2015).
- Federic, T., et al. Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs. Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).
- Ayers, J. I., et al. Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice. Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).
- Li, D., et al. Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS. Neuroscience. 365, 192-205 (2017).
- Borel, F., et al. Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).
- Wang, H., et al. Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis. Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).
- Wang, Y., et al. scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway. Brain Research. 1648, 1-10 (2016).
