Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos
Summary
Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.
Abstract
La inyección intratecal (IT) de virus adeno-asociado (AAV) ha atraído un considerable interés en la terapia génica del CNS en virtud de su eficacia de transducción excelente, seguridad y noninvasiveness en el SNC. Estudios anteriores han demostrado la potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por su administración. Sin embargo, se han reportado altas tasas de fracaso impredecible debido a la limitación técnica de administración de TI en pequeños animales. Aquí, hemos establecido un sistema de puntuación para indicar el grado de éxito de la punción lumbar en pequeños animales mediante la adición de clorhidrato de lidocaína 1% en la solución de la inyección. Se muestra más que el grado de debilidad transitoria después de la inyección puede predecir la eficiencia de la transducción de AAV. Por lo tanto, puede utilizarse este método de inyección de TI para optimizar los ensayos terapéuticos en modelos murinos de enfermedades del SNC que afligen a grandes regiones del SNC.
Introduction
AAV puede mediar la expresión génica a largo plazo y generalizados en la transducción del CNS con pocos efectos secundarios y por lo tanto, se ha convertido en uno de los vehículos más prometedoras para la terapia génica para el tratamiento de enfermedades del SNC incluyendo la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), Huntington enfermedad (HD), enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedades de depósito lisosomal (LSD), la enfermedad de Gaucher (GD) y neuronal ceroid lipofuscinosis ceroid (NCL)1. En la actualidad, más de 100 serotipos AAV se han aislado de los seres humanos y animales. Entre ellos, al menos 12 han sido utilizados en preclínicos y ensayos clínicos, incluyendo el más comúnmente utilizan vectores del gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 y rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Enfermedades del SNC diferentes requieren diferentes estrategias de entrega AAV debido a las diversas regiones afectadas de CNS y tipos de la célula. Las regiones de CNS y célula tipos que AAV puede transducir varía según el serotipo así como método de entrega. Por ejemplo, rAAVrh10 ha demostrado que transduce predominantemente astrocitos al entregado por la inyección intravenosa sistémica (IV), mientras que transduced las neuronas y glia entrega intratecal inyectable4,7. Además, inyección de parénquima dio lugar en la transducción de local a los alrededores del sitio de inyección, mientras que la inyección en el líquido cerebroespinal (CSF) a través de intraventricular o intratecal inyectable resultó en la transducción generalizada de CNS8 . Estudios también han demostrado potencia terapéutica de terapia génica AAV-entregado en trastornos neurodegenerativos por él administración9,10,11. En enfermedades que afectan a amplias zonas del SNC como ALS, inyección intratecal en el LCR se ha demostrado para cubrir la mayoría de las áreas que es afligida por la enfermedad con una dosis más baja, en comparación con un método de entrega sistémica4,10. Estudios recientes también han demostrado que la punción lumbar se puede utilizar para inyectar AAV en modelos de ratón de ALS, que evita posibles lesiones asociadas con cateterización de laminectomía e intratecal4.
Una punción lumbar directa experimental primero fue utilizada para entregar a agentes, especialmente los anestésicos, a la médula espinal para analgesia y anestesia en 188512,13. En este informe, nos ilustran el método de inyección es en ratones adultos con la ayuda del 1% clorhidrato de lidocaína, un anestésico local derivado de amida, en la solución de la inyección para evaluar y controlar la calidad de la inyección la punción lumbar. Inyecciones de éxito fueron marcadas por parálisis transitoria inducida por la lidocaína, mientras que inyecciones no mostró este comportamiento. Clasificamos el nivel de debilidad transitoria como uno de cinco grados para ayudar a predecir la eficacia de la inyección. Finalmente, nos muestran que el nivel de la transducción de rAAVrh10 puede predecirse por el grado de parálisis. Por lo tanto, este método de la entrega intratecal AAV puede utilizarse para mejorar el AAV-mediated gene-entrega para el tratamiento de enfermedades del SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Técnicamente, hay varios pasos críticos durante la inyección de IT en ratones despiertos. En primer lugar, adecuado gesto y firma el control de los ratones a lo largo de toda la operación es un requisito previo para la entrega exitosa. En segundo lugar, el punto más difícil es sentir el espacio intervertebral con la punta de la aguja, ya que es necesario no introducir demasiado profundamente sin resistencia o introduzca por la fuerza bajo fuerte resistencia en el caso de herir a los animales o doblar la punta de la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención de HEBEI Provincial Departamento de recursos humanos y Seguridad Social (CY201605) y una beca de la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Hebei (H2017206101), y estamos muy agradecidos al Dr. para Gao Guangping, quien proporcionó la AAV para Este estudio.
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
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