重组腺相关病毒在成年小鼠中的直接注射
Summary
在这里, 我们提出了一个直接鞘内注射技术使用1% 利多因盐酸在病毒溶液中, 以确保有效的腺病毒传递给小动物, 并建立评分系统, 以预测在中央的传导效率神经系统根据利多卡因引起的短暂虚弱程度。
Abstract
腺相关病毒 (aav) 的鞘内注射由于其安全性强、无创性和良好的转导效果, 在中枢神经系统基因治疗中引起了人们的极大兴趣。先前的研究已经证明了 aav 提供的基因治疗的治疗能力神经退行性疾病的 it 管理。然而, 据报道, 由于小动物信息技术管理的技术限制, 不可预测的故障率很高。在这里, 我们建立了一个评分系统, 以表明成功的程度, 腰椎穿刺在小动物通过添加1% 盐酸利多卡因注射溶液。进一步表明, 注入后瞬态弱点的程度可以预测 aav 的传导效率。因此, 该 it 注射方法可用于优化影响中枢神经系统广大区域的中枢神经系统疾病小鼠模型的治疗试验。
Introduction
aav 可以介导中枢神经系统转导中长期广泛的基因表达, 副作用不大, 因此已成为治疗包括肌萎缩侧索硬化症 (als) 在内的中枢神经系统疾病最有希望的载体之一。疾病 (hd)、阿尔茨海默病 (ad)、溶酶体储存疾病 (lsd)、高彻病 (gd) 和神经元类癫痫 (ncl)1。目前, 已有 100多个 aav 血清型从人类和动物中分离出来。其中, 至少有12种已用于临床前和临床试验, 包括最常用的基因载体, 如 aav1、2、4、5、6、8、9、raavrh.8 和 rAAVrh.8.101、2、3、4、 5,6。
由于受影响的中枢神经系统区域和细胞类型不同, 不同的中枢神经系统疾病需要不同的 aav 传递策略。aav 可以传递的中枢神经系统区域和细胞类型因血清类型和传递方法的不同而不同。例如, raavrh10 已被证明可以通过全身静脉注射 (iv) 传播主要的星形胶质细胞, 而当通过鞘内注射4,7时, 它传递神经元和胶质细胞。此外, 实质注射导致局部转导到注射部位附近, 而通过脑室内或鞘内注射进入脑脊液 (csf) 导致广泛的中枢神经系统转导8.研究还证明了 aav 提供的基因治疗的治疗能力神经退行性疾病 9,10,11。在影响中枢神经系统广泛领域的疾病中, 如 als, 与全身分娩方法 4,10 相比, 鞘内注射到脑脊液中的药物中注射已证明覆盖了大多数受疾病影响的地区,剂量较低。最近的研究还表明, 腰椎穿刺可用于在 als 小鼠模型中注射 aav, 从而避免了与椎板切除术和鞘内导管插入4相关的潜在损伤.
实验性直接腰椎穿刺于 1885年12,13首次用于向脊髓输送药物, 特别是麻醉剂, 用于镇痛和麻醉。在本报告中, 我们说明了腰椎穿刺 it 注射方法的成人小鼠的援助1% 利多卡因盐酸利多卡因, 一种局部胺衍生麻醉剂, 在注射溶液中评估和监测注射质量。成功注射的特点是脂质引起的短暂性麻痹, 而失败的注射并没有显示这种行为。我们将瞬态弱点的水平分为五个等级之一, 以帮助预测注射效率。最后, 我们表明, raavrh10 转导水平可以通过瘫痪等级来预测。因此, 这种鞘内 aav 传递方法可用于增强 aava 介导的基因传递, 用于中枢神经系统疾病的实验治疗。
Protocol
Representative Results
Discussion
从技术上讲, 在清醒小鼠的 it 注射过程中, 有几个关键步骤。首先, 在整个手术过程中, 正确的手势和对老鼠的坚定控制是成功分娩的先决条件。其次, 最困难的一点是用针尖感觉椎间间隙, 因为在伤害动物或弯曲针尖的情况下, 有必要不要在没有阻力的情况下插入太深或在强阻力下强行插入。第三, 尽管利多卡因短暂的瘫痪为 it 注射质量提供了一个客观的指标, 但还需要更多的实践来取得一致和成?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作的资金来自河北省人力资源和社会保障部的一笔赠款 (CY201605) 和河北省自然科学基金的赠款 (h201206101), 我们非常感谢高光平博士, 他为河北省提供了 aav。这项研究。
Materials
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
| 15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
| 1mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
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