Dieses Protokoll bietet einen effizienten Ansatz zur Messung von LDL-Cholesterin-Aufnahme mit Real-Time Zustrom Raten mit einem live Cell imaging-System in verschiedenen Zelltypen. Diese Technik bietet eine Plattform die pharmakologische Aktivität von Verbindungen beeinflussen LDL Zustrom während der Überwachung für Zellmorphologie und damit potenzielle Zytotoxizität auf dem Bildschirm.
Die Verordnung der LDL-Cholesterin-Aufnahme durch LDLR-vermittelte Endozytose ist ein wichtiger Bereich der Studie in verschiedenen wichtigen Krankheiten einschließlich Stoffwechselstörung, kardiovaskulären Erkrankungen und Nierenerkrankungen. Derzeit gibt es keine Methode, LDL-Aufnahme zu bewerten, während gleichzeitig Überwachung für die Gesundheit der Zellen. Die aktuelle Studie zeigt ein Protokoll, mit einer live Cell imaging Analysesystem auf Reihenmessungen LDL Zustrom mit gleichzeitiger Überwachung für Zellgesundheit erwerben. Diese neuartige Technik wird über einen vier-Stunden-Kurs in drei humanen Zelllinien (hepatische, renale tubuläre Epithelzellen und koronaren Arterie Endothelzellen) getestet. Darüber hinaus wird die Empfindlichkeit dieser Technik mit bekannten LDL-Aufnahme-Hemmer, Dynasore und rekombinante Protein PCSK9 sowie durch eine LDL-Aufnahme-Promotor, Simvastatin validiert. Zusammen genommen bietet diese Methode eine mittlere-hohe Durchsatz-Plattform für gleichzeitig screening pharmakologische Aktivität sowie die Überwachung der Zellmorphologie, also Zytotoxizität von Verbindungen, die Regulierung von LDL Zustrom. Die Analyse kann mit verschiedenen bildgebenden Systemen und Analyse-Software verwendet werden.
Die LDL Low Density Lipoprotein Rezeptor LDLR-vermittelte Endozytose ist ein wichtiger Bereich der Studie, da zirkulierende LDL-Cholesterinspiegel das Herzstück des Herz-Kreislauf-Krankheit1, Niere-Krankheit2 , sowie eine Vielzahl von entzündlichen sind transport von Krankheiten3 und genetische Erkrankungen mit Mutationen in Cholesterin Gene4,5,6,7. Studien in LDLR-vermittelten Cholesterin Zustrom führten zur Identifizierung von mehrere Recherche-Tools, wie z. B. Dynamin-Inhibitoren sowie die chemische Dynasore8,9,10, LDL-Regulierung Proteine wie Proprotein Konvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9)11,12.
Der LDL-LDLR-Endozytose-Weg beginnt mit den LDL-LDLR-Komplex auf der Zelloberfläche in Clathrin-coated Pits13Sequestrierung. Bläschen werden dann durch Einstülpung der Zellmembran Oberfläche Verinnerlichung des LDL-LDLR-Komplexes in Vakuolen für den Transport innerhalb der Zelle gebildet. Die gebildeten Vesikel in frühe und dann späte Endosomen reift, sinkt der pH-Wert innerhalb der späten Endosom, Distanzierung von der LDL von seinen Rezeptor14verursacht. In der Vergangenheit hing die Methoden zur Quantifizierung von LDL Zustrom von Radio-Label 125-LDL Co Inkubation mit Zellen und anschließende Extraktion des radioaktiv markierten Proteins aus Zellen zur Quantifizierung15. Dies wurde dann durch die Verwendung von Eindringmittel gekennzeichneten LDL-Proteine wie DiI-LDL und anschließende Immunostaining oder Extraktion des Proteins für fluoreszierende Lesungen mit einem Spektralphotometer oder Platte Leser15,16ersetzt. Eindringmittel gekennzeichnet wurde LDL auch in Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) für die Analyse der Internalisierung der LDL und Zelle Oberfläche LDL Bindung17eingesetzt. Während diese Methoden für die Erfassung von Daten nach der Behandlung ermöglichen, ist die Überwachung der Lebensfähigkeit der Zellen während der Behandlung nicht möglich.
Der saure pH-Wert in der späten Endosom ermöglicht den Einsatz einer pH aktiviert fluoreszierende LDL-Sonde wie pHrodo rot-LDL, die nach Internalisierung18,19fluoresziert. Diese Eigenschaft ermöglicht einen kontinuierlichen zeitlichen Verlauf der LDL-Aufnahme-Bewertung in lebenden Zellen. Daher nutzt dieses Protokoll pHrodo rot-LDL-Fluoreszenz-Bildgebung in live Zellanalyse, seriell Maßnahme LDL Aufnahme mit gleichzeitiger Überwachung für die Zellgesundheit. Die Ergebnisse zeigen die Zuverlässigkeit dieser neuartigen Technik wie über einen vier-Stunden-Kurs in drei verschiedenen humanen Zelllinien, menschlichen hepatischen Karzinomzellen (HepG2), menschlichen Nieren (HK2) Epithelzellen und menschlichen koronare arterielle Endothelzellen (HCAEC getestet ). Diese Zelllinien sind klinisch signifikanter LDL Abstand20,21,22,23,24,25,26,27 , Niere Krankheit28,29,30,31, und Herz-Kreislauferkrankungen32,33, beziehungsweise. Dieses Protokoll beinhaltet zusätzlich zur Überwachung des LDL-Zustroms, Behandlung mit zwei bekannten LDL-Aufnahme-Hemmer, Dynasore Hydrat und rekombinanten Proteins PCSK9 sowie ein statin Induktor von LDLR Ausdruck und LDL-Aufnahme, Simvastatin. Dynasore und rekombinante PCSK9 jedes arbeiten über verschiedene Wege zur Verringerung der LDL-Aufnahme.
Dynasore ist ein kleines Molekül-Hemmer von Dynamins10 und senkt LDL-Aufnahme blockieren Clathrin-abhängige Endozytose von LDL-LDLR Komplex10,34. Rekombinante PCSK9 ist auf der anderen Seite Mitglied Peptidase S8-Familie, die LDLR bindet und hemmt das recycling an die Zelloberfläche nach der Veröffentlichung von LDL aus dem verinnerlichten Komplex durch die Blockierung erforderlich Konformationsänderungen35,36 . Verminderte Oberfläche LDLR Zelldichte führt schließlich zum reduzierten LDL-Aufnahme von der Zelle. Statine, sind beim direkt Blocken der 3-hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym (HMG-CoA)-Reduktase Enzym und damit die Cholesterin-Biosynthese, auch Upregulate den Ausdruck des LDLR25,38 führt zu erhöhte LDL-Aufnahme bekannt. Die Empfindlichkeit dieses Protokolls wird überprüft, indem er erkennt erhebliche Reduzierungen in LDL Zustrom in drei klinisch relevante humanen Zelllinien, HK2, HepG2 und HCAECs, durch Dynasore und/oder rekombinante PCSK9, und eine deutliche Zunahme der LDL-Aufnahme in HepG2-Zellen durch Simvastatin in einem vier-Stunden-Kurs mit Überwachung für Zelle Morphologie/Gesundheit. Zusammen genommen bietet diese Methode eine mittlere-hohe Durchsatz-Plattform für das screening gleichzeitig die pharmakologische Aktivität und Zytotoxizität von Verbindungen, die Regulierung der LDL-Aufnahme in lebenden Zellen.
In das aktuelle Protokoll zeigen wir Ihnen die Nutzung von live Cell Imaging als eine neue und effektivere Methode zur Messung der Echtzeit LDL-Aufnahme über einen zeitlichen Verlauf in verschiedenen humanen Zelllinien. Menschlichen hepatischen Karzinomzellen (HepG2) werden häufig in Studien screening für Cholesterin-senkende Therapie21,22,23,24,25,26verwendet, 39,40. Daher entschieden wir uns für die Prüfung der Fähigkeit eines live Cell imaging Systems für LDL Zustrom Studien dieser Zellentyp. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass HepG2-Zellen mit dieser neuen Technik und führen zu einer sigmoid-ähnliche Kurve, die kontinuierliche LDL-Aufnahme für die Dauer der Zustrom Assay bis 4,33 h als den finalen Endpunkt kompatibel sind (Abbildung 2A und Abbildung 3 ).
Cholesterin-Homöostase spielt eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der verschiedenen Nephropathies. In der Tat, Cholesterin-Ansammlung in renal Gewebe ist ein wesentlicher Faktor für renale Fibrose führt zu chronischer Nierenerkrankung und ist eine große Pathologie in verschiedenen Nephropathies28,29,30,31. Daher haben wir unsere Methode im menschlichen Nieren (HK2) Epithelzellen als eine beliebte und zuverlässige Zelllinie verwendet auf dem Gebiet der Nephrologie untersucht. Unsere Daten unterstützt auch die Machbarkeit des live Cell imaging Systems, LDL Zustrom in HK2 Zellen zu messen. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, nahm HK2 Zellen LDL-Cholesterin linear während der gesamten Dauer der Zustrom Studie (4 Stunden).
Aufgrund der Bedeutung der Cholesterin-Stoffwechsel in der Entwicklung und Progression der Atherosklerose32,33,41, die führende Ursache von Herz-und Kreislauferkrankungen, die wiederum die Nummer eins Todesursache weltweit 42, wollten wir unsere Methode in einer Atherosklerose-relevanten Zelltyp zu validieren. Wir haben menschliche koronare arterielle Endothelzellen (HCAECs), sind eines der ersten Zelle Arten eine Beleidigung des Cholesterin in die Koronararterie Lumen eine Arteriosklerose-Patienten ausgesetzt werden. Unsere Daten, dargestellt in Abbildung 2C zeigt, dass diese LDL Zustrom Methode auch mit HCAECs effektiv funktioniert. Das resultierende Diagramm ist eine sigmoid-ähnliche Kurve ähnlich dem von HepG2-Zellen.
Um die Gültigkeit und die Empfindlichkeit des verbesserten LDL Zustrom Assays für das screening von Verbindungen beeinflussen LDL-Cholesterin-Aufnahme zu testen, haben wir drei Steuerelemente, LDL Aufnahme-senkende Mittel Dynasore und rPCSK9 und LDL Zustrom Aktivator Simvastatin. Hier behandelt wir die oben genannten Zelllinien (HepG2, HK2 und HCAECs) mit optimierten Konzentrationen von Dynasore oder rPCSK9 vor dem Zustrom-Assay. Unsere Resultate zeigten, dass alle drei getesteten Zelllinien auf die Behandlungen mit signifikante Reduzierung des LDL Zustrom über einen 4-Stunden-Kurs (Abbildung 2 reagierte). Zum Beispiel bei 4,33 h als der endgültige Zeitpunkt, Behandlung mit Dynasore bei 40 µM deutlich reduziert LDL Zustrom in HepG2-Zellen, HK2 Zellen und HCAECs um 53 %, 68 % bzw. 54 %, bzw. (p < 0,0001; Abbildung 2 A-C und Tabelle 2A-C). Darüber hinaus verursacht rPCSK9 bei 10 µg/mL eine deutliche Reduktion von 55 % im LDL Zustrom in HK2 Zellen (p < 0,0001; Abbildung 2 B und Tabelle 2 b). Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Behandlung von HepG2-Zellen mit Simvastatin führte zu einer deutlichen Zunahme LDL-Aufnahme (Abbildung 3), unterstützen die Empfindlichkeit dieser Methode, wesentliche Veränderungen in der LDL-Zustrom zu erkennen. Studien zur Behandlung mit rPCSK9 in HepG2 und HCAEC Zellen sind in diesem Protokoll nicht berücksichtigt, da rPCSK9 als zusätzliche Kontrollbehandlung mit gut dokumentierten Ergebnissen dient, aber teuer ist, in kleinen Mengen zu kaufen. Deshalb war rPCSK9 nur verwendet, um dieses Protokoll in HK2 Zellen zu validieren.
Live Cell imaging-Analyse, sowie die funktionale und zeitnahe Messung von LDL Zustrom, zugelassen für eine kontinuierliche Überwachung der Gesundheit und der Morphologie der Zellen. Dieser Vorteil kann effizient mögliche Zytotoxizität der angewandten Verbindungen, so dass diese Methode eine ideale Technik für die Überwachung gleichzeitig pharmakologische Aktivität und Zytotoxizität erkennen. Zahlen 5 bis 7 repräsentative Bilder der drei getesteten Zelllinien an den finalen Endpunkt (4,33 h) als visuelle Referenz für den Effekt der Behandlungen auf Netto LDL Zustrom zu veranschaulichen und zeigt auch die gesunde Morphologie der Zellen nach der getesteten Behandlungen. Wir empfehlen Sichtprüfung aller Bilder aus jedem Brunnen um die heathy Morphologie der Zellen für die Dauer der Studie zu gewährleisten. Zum Beispiel in Daten nicht angezeigt, wenn Bilder von HepG2-Zellen mit 80 μM behandelt Dynasore geprüft wurden, beobachteten wir Hinweise auf Zelle ablösen, wie die Zellränder erschien die Platte abheben, was auf Zelle Ablösung bei höheren Konzentrationen von Dynasore. Darüber hinaus induzierte hohe Konzentrationen von Simvastatin (3 – 10 μM) führte auch zu veränderten Morphologie zeigt Apoptose wie für hohe Dosierungen von Statinen45berichtet. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine Titrierung der Dynasore Behandlung bei 20-80 μM und Simvastatin bei 0,5-10 μM Konzentration, woraufhin die Zelle Bilder verwendet wurden, um die Gesundheit der Zellen zu analysieren und ermitteln potenzielle Ctotoxicity der Behandlungen im durchführen verschiedenen Konzentrationen. Ergebnisse vorgeschlagen, die Verwendung von 40 μM für Dyansore und 1 μM für Simvastatin als optimalen Konzentrationen.
Zu guter Letzt empfehlen wir eine Zelle Dichte Titration Studie durchführen, wenn eine andere Zell-Linie mit dieser Methode untersucht werden, Ermittlung der optimalen Zellzahl pro Bohrloch um konsistente Ergebnisse zu erhalten soll. Unsere Zelle Dichte Optimierungsstudie zeigte, dass 10.000 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte zu konsequenten LDL Zustrom Ergebnissen für HK2 und HCAE Zellen führen. Es ist wichtig zu beachten, dass für diese LDL Zustrom Assay mit live Cell imaging-System, eine Monolage von nicht-Zusammenfluss Zellen verteilt sich gleichmäßig auf die Brunnen wünschenswert ist, wie Klumpen von Zellen zu Fehlern in der normalisierten LDL Zustrom Endwerte führen können. Der Grund dafür ist, dass für die Normalisierung der Zustrom Daten, der Objektbereich Phase als Maß für die Zelldichte dient und dieser Parameter kann beeinträchtigt werden, wenn Zelle Klumpen gebildet werden. Wir beobachteten, dass HepG2-Zellen eine Tendenz zu Form Klumpen haben wenn bei dichten höher als 5.000 Zellen/Brunnen verursacht inkonsistente Zustrom Ergebnisse ausgesät; Daher haben wir 5.000 Zellen pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte als optimale Dichte für HepG2-Zellen.
Gemeinsam, bietet unsere Methode eine mittlere-hohe Durchsatz-Plattform für das screening der pharmakologischen Aktivität und Zytotoxizität von Verbindungen gleichzeitig LDL Zustrom regulieren. Diese Methode kann für die Verwendung mit anderen Fluoreszent-markierten Liganden leicht angepasst werden, die das lysosomale Fach um Liganden Aufnahme in Echtzeit auswerten eingeben. Während dieses Protokoll bietet Spezifikationen für InCucyte live imaging und Analysesystem, das Protokoll für alternative bildgebende Systeme wie Cellomics angepasst werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die folgenden Zuschüsse an LAS: National Institute of Health (R56HL132209 und 1R01HL140468) und Miami Heart Research Institute. KY ist American Heart Association Predoctoral Fellow (18PRE33960070). HepG2-Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Emmanuel Thomas, Universität von Miami-Miller-Schule von Medizin46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |