يوفر هذا البروتوكول نهج فعالة لقياس امتصاص الكوليسترول LDL مع معدلات تدفق الوقت الحقيقي باستخدام خلية يعيش التصوير النظام في مختلف أنواع الخلايا. هذا الأسلوب يوفر منبرا الشاشة النشاط الدوائي للمركبات التي تؤثر على تدفق LDL في حين رصد مورفولوجيا الخلايا وسيتوتوكسيسيتي المحتملة ومن ثم.
تنظيم امتصاص الكوليسترول LDL من خلال وساطة لدلر الالتقام مجالاً هاما للدراسة في مختلف الأمراض الرئيسية بما في ذلك الاضطرابات الأيضية وأمراض القلب والأوعية الدموية، وأمراض الكلي. حاليا، لا يوجد أي أسلوب متاح لتقييم امتصاص LDL بينما رصد في الوقت ذاته على صحة الخلايا. ويعرض الدراسة الحالية بروتوكول، باستخدام نظام تحليل تصوير خلايا حية، للحصول على القياسات المسلسل LDL التدفق مع الرصد المتزامن لصحة الخلية. يتم اختبار هذه التقنية الجديدة في ثلاثة خطوط الخلايا البشرية (الكبد, كلوي أنبوبي الشريان الظهارية، والشريان التاجي خلايا بطانية) مر وقت أربع ساعات. وعلاوة على ذلك، يتم التحقق من حساسية هذا الأسلوب مع معروفة مثبطات امتصاص الكولسترول وديناسوري والمؤتلف بروتين PCSK9، وكذلك مروج امتصاص الكولسترول، سيمفاستاتين. أخذت معا، هذا الأسلوب يوفر منبرا متوسطة إلى عالية إنتاجية لفحص النشاط الدوائي في وقت واحد، فضلا عن رصد مورفولوجيا الخلايا، ومن ثم سيتوتوكسيسيتي مركبات التي تنظم تدفق LDL. يمكن استخدام التحليل مع مختلف نظم التصوير والبرامج التحليلية.
الالتقام LDL منخفض الكثافة Lipoprotein مستقبلات لدلر بوساطة مجالاً هاما للدراسة منذ تعميم مستويات الكولسترول LDL لب1من أمراض القلب والأوعية الدموية، وأمراض الكلي2 ، فضلا عن مجموعة متنوعة من الالتهابات 3 من الأمراض والاضطرابات الوراثية مع الطفرات في نسبة الكولسترول في الدم نقل الجينات4،5،،من67. وقد أدت الدراسات في تدفق الكوليسترول لدلر بوساطة لتحديد أدوات البحث متعددة، مثل مثبطات دينامين بما في ذلك الكيميائية دينسور8،،من910، فضلا عن تنظيم LDL اكتب البروتينات مثل كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/كيكسن11،(PCSK9) 912.
ويبدأ المسار الالتقام LDL-لدلر عزل المجمع LDL-لدلر على سطح الخلية في حفر مكسوة كلاثرين13. ثم تتشكل حويصلات من إينفاجينيشن لغشاء الخلية السطحية استيعاب المجمع LDL-لدلر في فاكوليس للنقل داخل الخلية. نضوج حويصلة المشكلة في اندوسوميس المبكرة والمتأخرة ثم قطرات درجة الحموضة داخل دخلول الراحل، مما تسبب في عدم اقتران LDL من مستقبلات لها14. في الماضي، تعتمد أساليب القياس الكمي لتدفق LDL على المسمى الإذاعة 125-LDL حضانة المشارك مع الخلايا واستخراج اللاحقة من البروتين المسمى الإذاعة من الخلايا لتحديد مقدار15. هذا وكان ثم الاستعاضة عن استخدام المسمى فلوريسسينتلي LDL بروتينات مثل دي-LDL، وإيمونوستينينج اللاحقة أو استخراج البروتين لقراءات الفلورسنت باستخدام جهاز المطياف الضوئي أو لوحة15،قارئ16. فلوريسسينتلي المسمى LDL أيضا استخدمت في خلية تنشيط Fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتحليل للاستيعاب الكولسترول والخلايا السطحية LDL ملزمة17. بينما تسمح هذه الطرق لجمع البيانات بعد المعالجة، رصد جدوى الخلايا أثناء العلاج لا يمكن.
الرقم الهيدروجيني الحمضية في دخلول الراحل يسمح باستخدام مجس LDL الفلورسنت تنشيط الأس الهيدروجيني مثل فرودو LDL الأحمر التي فلوريسسيس بعد استيعاب18،19. تتيح هذه الخاصية لدورة وقت مستمرة لتقييم امتصاص الكولسترول في الخلايا الحية. ولذلك، يستخدم هذا البروتوكول فرودو الأحمر-LDL fluorescence التصوير في تحليل خلية حية لقياس LDL في الإقبال على التسلسل مع الرصد المتزامن لصحة الخلية. وتشير النتائج إلى موثوقية هذه التقنية الجديدة كما تم اختبارها على مدى دورة وقت أربع ساعات في ثلاثة خطوط الخلايا البشرية المختلفة والخلايا البشرية سرطان الكبد (HepG2)، والخلايا الكلوية البشرية الظهارية (HK2) والشريان التاجي الشرياني غشائي الخلايا البشرية (هكايك ). هذه الخطوط الخلية مهمة سريرياً الكولسترول تطهير20،21،،من2223،24،25،26،27 ، الكلي المرض28،29،،من3031، و32،أمراض القلب33، على التوالي. بالإضافة إلى رصد تدفق LDL، يتضمن هذا البروتوكول المعالجة بمثبطات امتصاص الكولسترول المعروفة اثنين، هيدرات دينسور والمؤتلف PCSK9 البروتين، فضلا عن محفز ستاتين التعبير لدلر وامتصاص الكولسترول، سيمفاستاتين. دينسور المؤتلف PCSK9 كل العمل من خلال مسارات مختلفة للحد من امتصاص الكولسترول.
دينسور مثبط جزيء صغير من دينامينس10 ويقلل من امتصاص الكولسترول بحجب الالتقام كلاثرين-تعتمد على LDL-لدلر معقدة10،34. PCSK9 المؤتلف، من ناحية أخرى، هو عضو peptidase S8 الأسرة التي تربط بين لدلر ويحول دون إعادة تدويرها إلى سطح الخلية بعد الإفراج عن LDL من المجمع المدخلة عن طريق حظر التغييرات المطلوبة كونفورماشونال35،36 . خلية انخفاض الكثافة لدلر السطحية يؤدي في النهاية إلى انخفاض امتصاص الكولسترول بالخلية. Statins، حين وقف مباشرة 3-هيدروكسي-3-ميثيلجلوتاريل-إنزيم إنزيم ريدكتيز (حكومة صاحبة الجلالة-CoA) ومن ثم تخليق الحيوي الكولسترول، من المعروف أيضا أن أوبريجولاتي التعبير عن لدلر25،38 مما يؤدي إلى زيادة امتصاص LDL. يتم التحقق من حساسية هذا البروتوكول عن طريق الكشف عن تخفيضات كبيرة في تدفق الكولسترول في الخلايا البشرية ذات الصلة سريرياً ثلاثة خطوط، HK2، HepG2 وهكايكس، ديناسوري و/أو المؤتلف PCSK9، وزيادة ملحوظة في امتصاص الكولسترول في الخلايا HepG2 قبل سيمفاستاتين في مسلك وقت أربع ساعات مع رصد للخلية مورفولوجيا/الصحة. أخذت معا، هذا الأسلوب يوفر منبرا متوسطة إلى عالية إنتاجية للفحص في نفس الوقت على النشاط الدوائي وسيتوتوكسيسيتي من مركبات تنظم امتصاص الكولسترول في الخلايا الحية.
في البروتوكول الحالي، ندلل على الاستفادة تصوير الخلية الحية كطريقة جديدة وأكثر فعالية لقياس الوقت الحقيقي LDL الإقبال مر وقت في خطوط الخلايا البشرية المختلفة. ويشيع استخدام الخلايا البشرية سرطان الكبد (HepG2) في دراسات فحص الكولسترول المداواة21،،من2223،24،،من2526، 39،40. لذلك، اخترنا هذا النوع الخلية لاختبار قدرة نظام التصوير خلية حية للدراسات تدفق LDL. نتائجنا تشير إلى أن الخلايا HepG2 متوافقة مع هذه التقنية الجديدة والنتيجة في منحنى سينية مثل يشير إلى امتصاص LDL مستمرة طوال مدة الفحص تدفق حتى ح 4.33 كنقطة نهائية (الشكل 2 ألف و 3 الرقم ).
التوازن الكولسترول يلعب دوراً رئيسيا في الفسيولوجيا المرضية لمختلف نيفروباثيس. والواقع أن تراكم الكولسترول في الأنسجة الكلوية مساهما رئيسيا في التليف الكلوي مما يؤدي إلى أمراض الكلي المزمنة وهو علم أمراض رئيسية في مختلف نيفروباثيس28،،29،،من3031. ومن ثم، قمنا بفحص أسلوبنا في الخلايا الكلوية البشرية الظهارية (HK2) كخط خلية شعبية ويعول عليها تستخدم في مجال أمراض الكلي. لدينا بيانات تؤيد أيضا جدوى نظام التصوير بخلية حية لقياس تدفق الكولسترول في الخلايا HK2. كما هو مبين في الشكل 2ب، والخلايا HK2 تناول الكولسترول خطيا طوال مدة الدراسة تدفق (4 ساعات).
وبسبب أهمية استقلاب الكولسترول في التنمية والتقدم لتصلّب الشرايين32،،من3341، السبب الرئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية، الذي بدوره هو القاتل رقم واحد في العالم 42، نحن تهدف إلى التحقق من صحة أسلوبنا في نوع خلية ذات صلة بتصلب الشرايين. كنا “التاجية الشرايين غشائي الخلايا البشرية” (هكايكس)، أن هذه أحد أنواع الخلية الأولى للتعرض لإهانة الكولسترول في تجويف الشريان التاجي لمريض تصلب الشرايين. البيانات المتوفرة لدينا هو مبين في الشكل 2ج يشير إلى أن هذا الأسلوب تدفق LDL تعمل أيضا بفعالية مع هكايكس. الرسم البياني الناتج منحنى سينية مثل مماثلة لتلك الخلايا HepG2.
لاختبار صلاحية وحساسية هذه المقايسة تدفق LDL محسنة لفحص المركبات التي تؤثر على امتصاص الكوليسترول LDL، استخدمنا ثلاثة عناصر وعوامل خفض امتصاص LDL دينسور و rPCSK9 والمنشط تدفق LDL سيمفاستاتين. هنا، علينا التعامل مع ما ورد أعلاه المذكورة خطوط الخلايا (HepG2 و HK2 وهكايكس) بتركيزات الأمثل من دينسور أو rPCSK9 قبل فحص التدفق. وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن كل ثلاثة خطوط الخلية اختبار رد على العلاجات مع تخفيضات كبيرة في تدفق LDL مر وقت 4 ساعة (الشكل 2). على سبيل المثال، في ح 4.33 نقطة الوقت النهائي، المعاملة مع دينسور في 40 ميكرومتر يقلل بدرجة تدفق LDL في HepG2 الخلايا والخلايا HK2 وهكايكس من 53 في المائة، ونسبة 68 في المائة و 54 في المائة، على التوالي (ف < 0.0001؛ الشكل 2 أ-ج و الجدول 2 ألف-ج). وباﻹضافة إلى ذلك، تسبب rPCSK9 في 10 ميكروغرام/مل 55% انخفاض ملحوظ في تدفق الكولسترول في الخلايا HK2 (ف < 0.0001؛ الشكل 2 ب و الجدول 2 باء). وعلاوة على ذلك، أظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن علاج الخلايا HepG2 مع سيمفاستاتين أدى إلى زيادة ملحوظة في امتصاص LDL (الشكل 3)، دعم حساسية هذا الأسلوب للكشف عن تغييرات كبيرة في تدفق LDL. الدراسات المتعلقة بالمعاملة مع rPCSK9 في خلايا HepG2 وحكاك غير مدرجة في هذا البروتوكول كما rPCSK9 يستخدم كعلاج تحكم إضافية مع النتائج الموثقة توثيقاً جيدا، ولكن مكلف بشراء كميات صغيرة. ولذلك لا يستخدم إلا rPCSK9 للتحقق من صحة هذا البروتوكول في الخلايا HK2.
يعيش خلية التصوير التحليل، جنبا إلى جنب مع قياس التدفق LDL، يسمح للرصد المستمر للصحة ومورفولوجيا الخلايا الوظيفية، وفي الوقت المناسب. ويمكن اكتشاف هذه الميزة كفاءة سيتوتوكسيسيتي المحتملة من المركبات التطبيقية، مما يجعل هذا الأسلوب أسلوباً مثاليا في نفس الوقت رصد النشاط الدوائي وسيتوتوكسيسيتي. الأرقام 5-7 توضيح الصور التمثيلية لثلاثة خطوط الخلية تم اختبارها في نقطة النهاية النهائية (4.33 ح) كمرجع مرئي لتأثير العلاجات على صافي تدفق LDL ويظهر أيضا مورفولوجية صحية من الخلايا التالية تم اختبارها العلاجات. ونحن نوصي التفتيش البصري لجميع الصور من كل بئر ﻹعطاء مورفولوجية حياتي من الخلايا لمدة الدراسة. على سبيل المثال، في البيانات التي لم تظهر عند الصور HepG2 الخلايا تعامل مع 80 ميكرومتر وتم تفتيش دينسور، لاحظنا مؤشرات على الخلية المفرزة حواف الخلايا فيما يبدو أن رفع قبالة اللوحة، مما يشير إلى خلايا مفرزة في تركيزات أعلى من ديناسوري. وعلاوة على ذلك، تركيزات عالية من سيمفاستاتين (3-10 ميكرومترات) أدى أيضا إلى تغير مورفولوجيا يشير إلى فعل المبرمج المبلغ عنها بالنسبة لجرعات عالية من statins45. وكان استخدام هذا البروتوكول للقيام معايرة معاملة دينسور في 20-80 ميكرومتر، وسيمفاستاتين بتركيز 0.5-10 ميكرومترات، عقب الصور خلية كانت تستخدم لتحليل صحة الخلايا وتحديد كتوتوكسيسيتي المحتملة من العلاجات في تركيزات مختلفة. النتائج اقترح استخدام 40 ميكرومتر دينسور و 1 ميكرومتر سيمفاستاتين التركيزات المثلى.
وأخيراً، فإننا نقترح إجراء دراسة معايرة كثافة خلية إذا كان خط خلية آخر اختبار باستخدام هذا الأسلوب من أجل تحديد العدد الأمثل الخلية الواحدة وكذلك للحصول على نتائج متسقة. وأظهرت دراستنا الأمثل كثافة الخلية أن 10,000 الخلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا يؤدي إلى LDL تدفق نتائج متسقة للخلايا HK2، وحق. من المهم أن نلاحظ أن لهذه الخلية الحية نظام التصوير باستخدام مقايسة تدفق LDL، أحادي الطبقة خلايا غير روافد موزعة بالتساوي على الآبار مرغوب فيه ككتل من الخلايا يمكن أن تؤدي إلى أخطاء في القيم تدفق LDL تم تسويتها النهائية. السبب في ذلك هو أن لتطبيع تدفق البيانات، مساحة الكائن المرحلة يستخدم كمقياس لكثافة الخلية وهذه المعلمة يمكن أن تتأثر سلبا عندما تتشكل كتل الخلية. لاحظنا أن الخلايا HepG2 لديهم ميل إلى كتل النموذج عندما تبذر في كثافة أعلى من 000 5 خلايا/جيدا مما تسبب في تدفق تتعارض النتائج؛ ولذلك، نحن كخلايا 5,000 كل بئر في لوحة 24-جيدا الكثافة المثلى للخلايا HepG2.
جماعياً، لدينا أسلوب يوفر منبرا متوسطة إلى عالية إنتاجية لفحص النشاط الدوائي وسيتوتوكسيسيتي من المركبات التي تنظم تدفق LDL في نفس الوقت. يمكن أن يكون هذا الأسلوب يسهل تطويعها للاستخدام مع غيرها يغاندس المسمى فلوريسسينتلي الذي أدخل حجرة الليزوزومية تقييم امتصاص يجند في الوقت الحقيقي. بينما يقدم هذا البروتوكول مواصفات إينكوسيتي يعيش التصوير وتحليل النظام، البروتوكول يمكن تكييفها لنظم التصوير البديلة مثل سيلوميكس.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمها المنح التالية لجامعة الدول العربية: المعهد الوطني للصحة (R56HL132209 و 1R01HL140468) ومعهد بحوث القلب في ميامي. KY مستلم جمعية القلب الأمريكية زمالة بريدوكتورال (18PRE33960070). وقدم الدكتور إيمانويل توماس، جامعة ميامي ميلر مدرسة الطب46،،من4748يرجى HepG2 الخلايا.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |