Dit protocol biedt een efficiënte aanpak voor het meten van LDL cholesterol opname met real-time toestroom tarieven met behulp van een levende cel imaging systeem in verschillende celtypen. Deze techniek biedt een platform voor het scherm van de farmacologische activiteit van verbindingen op het gebied van LDL toestroom terwijl monitoring voor cel morfologie en vandaar potentiële cytotoxiciteit.
De regulering van de LDL cholesterol opname via LDLR-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie in verschillende grote pathologieën waaronder stofwisselingsziekte, hart-en vaatziekten en nieraandoeningen. Op dit moment is er geen beschikbare methode te beoordelen LDL opname terwijl tegelijkertijd toezicht op voor de gezondheid van de cellen. De huidige studie presenteert een protocol, met behulp van een levende cel imaging analysesysteem, te verwerven van de periodieke metingen van LDL toestroom met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. Deze nieuwe techniek wordt in een vier uur durende tijdsverloop in drie menselijke cellijnen (hepatische, renale tubulaire epitheliale en coronaire slagader endotheliale cellen) getest. De gevoeligheid van deze techniek is bovendien gevalideerd met bekende LDL opname remmers, Dynasore en recombinant PCSK9 eiwit, alsook door een LDL opname promotor, simvastatine. Samen genomen, biedt deze methode een medium tot hoge doorvoer platform voor gelijktijdig screening farmacologische activiteit, alsmede het toezicht op de morfologie van de cel, vandaar cytotoxiciteit van verbindingen regulering van de toestroom van de LDL. De analyse kan worden gebruikt met verschillende beeldvormende systemen en analytische software.
De LDL Low Density Lipoprotein LDLR Receptor-gemedieerde endocytose is een belangrijk gebied van studie, aangezien circulerende LDL-cholesterol waarden de kern van hart-en vaatziekten1, nier ziekte2 evenals een verscheidenheid van inflammatoire vormen 3 van de ziekten en genetische aandoeningen met mutaties in cholesterol vervoeren genen4,,5,,6,7. Studies in LDLR-gemedieerde cholesterol toestroom hebben geleid tot de identificatie van meerdere onderzoek-hulpprogramma’s, zoals Dynamin-remmers waaronder de chemische Dynasore8,9,10, evenals LDL-regulering eiwitten zoals Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9)11,12.
De LDL-LDLR endocytose traject begint met het vastleggen van de LDL-LDLR-complex op het celoppervlak in clathrin beklede kuilen13. Blaasjes worden dan gevormd door invagination van de oppervlakte celmembraan internalisering van de LDL-LDLR-complex in de vacuolen voor transport binnen de cel. Aangezien de gevormde vesikel in vroege en vervolgens late Endosomen rijpt, druppels de pH in de late endosome, veroorzaakt door scheiding van het LDL uit de receptor14. In het verleden, zijn de methoden van kwantificering van LDL toestroom afhing van radio-geëtiketteerden 125-LDL co incubatie met cellen en latere extractie van de radioactief gemerkt proteïne uit cellen voor kwantificering15. Dit werd vervolgens vervangen door het gebruik van fluorescently geëtiketteerde LDL eiwitten zoals DiI-LDL, en latere immunokleuring of extractie van eiwitten voor fluorescerende lezingen met een spectrofotometer of plaat lezer15,16. Fluorescently geëtiketteerd is LDL ook gebruikt in fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor analyse van internalisering van de LDL en cel oppervlakte LDL bindende17. Terwijl deze methoden toestaan voor het verzamelen van gegevens na de behandeling, is toezicht op de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de behandeling niet mogelijk.
De zure pH in de late endosome maakt het gebruik van een pH-geactiveerde fluorescerende LDL sonde zoals pHrodo Red LDL die na internalisering18,19 fluoresceert. Deze eigenschap zorgt voor een continue tijdsverloop van LDL opname beoordeling in levende cellen. Dit protocol maakt daarom gebruik van pHrodo Red-LDL fluorescentie imaging in een levende cel analyse naar serieel maatregel LDL opname met gelijktijdige monitoring voor de gezondheid van de cel. De resultaten geven de betrouwbaarheid van deze nieuwe techniek als getest in een vier uur durende tijdsverloop in drie verschillende menselijke cellijnen, menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen, menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) en menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAEC ). Deze cellijnen zijn klinisch significante LDL klaring20,21,22,23,24,25,26,27 , nier ziekte28,29,30,31, en hart-en vaatziekten32,33, respectievelijk. Naast het controleren van de LDL-instroom, neemt dit protocol behandeling met twee bekende remmers van de opname van het LDL, Dynasore hydraat en recombinant PCSK9 eiwit, alsmede een statine inductor van LDLR meningsuiting en LDL opname, simvastatine. Dynasore en recombinant PCSK9 elk werken via verschillende wegen te verminderen LDL opname.
Dynasore is een klein molecuul inhibitor van Dynamins10 en LDL opname vermindert door het blokkeren van clathrin-afhankelijke endocytose van LDL-LDLR complex10,34. Recombinant PCSK9, aan de andere kant, is een lid van peptidase S8 familie die bindt aan LDLR en remt de recycling naar het celoppervlak na het loslaten van LDL van de verinnerlijkte complex door het blokkeren van de vereiste conformationele veranderingen35,36 . Verminderde oppervlakte LDLR celdichtheid leidt uiteindelijk tot lagere LDL opname door de cel. Statines, zijn terwijl het direct blokkeren van de 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reductase enzymen en dus de biosynthese van cholesterol, ook bekend te upregulate de expressie van LDLR25,38 leidt tot verhoogde LDL opname. De gevoeligheid van dit protocol is gevalideerd door het detecteren van aanzienlijke vermindering in LDL toestroom in drie klinisch relevante menselijke cellijnen, HK2, HepG2 en HCAECs, door Dynasore en/of recombinant PCSK9, en een duidelijke stijging van de LDL opname in de cellen van de HepG2 door Simvastatine in een vier uur durende tijd cursus met monitoring voor cell morfologie/gezondheid. Tezamen, biedt deze methode een platform voor medium tot hoge doorvoersnelheid om gelijktijdig te screenen de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen regulering van LDL opname in levende cellen.
In het huidige protocol, we laten zien op het gebruik van levende cellen imaging als een nieuwe en effectievere methode voor het meten van real-time LDL opname in een tijdsverloop in verschillende menselijke cellijnen. Menselijke hepatische carcinoom (HepG2) cellen worden vaak gebruikt in studies screening voor cholesterol-verlagende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Daarom kozen we dit celtype voor het testen van het vermogen van een levende cel imaging systeem voor LDL toestroom studies. Onze resultaten wijzen erop dat HepG2 cellen verenigbaar zijn met deze nieuwe techniek en het resultaat in een bocht van de sigmoid-achtige continu LDL-opname voor de duur van de toestroom bepaling die aangeeft tot 4.33 h als het definitieve eindpunt (figuur 2A en Figuur 3 ).
Homeostase van cholesterol speelt een belangrijke rol in de pathofysiologie van verschillende nephropathies. Inderdaad, cholesterol accumulatie in renal weefsel is een belangrijke bijdrage aan de renale fibrose leiden tot chronische nierziekte en is een grote pathologie in verschillende nephropathies28,29,30,31. Vandaar, wij onze methode in menselijke renale epitheliale cellen van de (HK2) onderzocht als een populaire en betrouwbare cellijn gebruikt op het gebied van Nefrologie. Onze gegevens ondersteunde ook de haalbaarheid van de levende cel imaging systeem voor het meten van LDL toestroom in HK2 cellen. Zoals afgebeeld in Figuur 2B, pakte HK2 cellen LDL cholesterol lineair gedurende de looptijd van de toestroom studie (4 uur).
Vanwege het belang van het metabolisme van cholesterol in de ontwikkeling en de progressie van aderverkalking32,33,41, de belangrijkste oorzaak van hart-en vaatziekten, die op zijn beurt de nummer 1 moordenaar wereldwijd is 42, we gericht op het valideren van onze werkwijze in een atherosclerose-relevante celtype. We gebruikten menselijke coronaire arteriële endotheliale cellen (HCAECs), zoals dit een van de eerste celtypen zijn te worden blootgesteld aan een belediging van de cholesterol in het lumen van de kransslagader van een patiënt van atherosclerose. Onze gegevens weergegeven in Figuur 2C geeft aan dat deze LDL toestroom methode ook effectief met HCAECs werkt. De resulterende grafiek is een sigmoid-achtige kromme vergelijkbaar met die van HepG2 cellen.
Om te testen op de geldigheid en de gevoeligheid van deze verbeterde LDL toestroom assay voor het screenen van stoffen beïnvloeden de opname van de LDL-cholesterol, gebruikten we drie besturingselementen, LDL opname-verlagende agenten Dynasore en rPCSK9 en LDL toestroom activator simvastatine. Hier, we de bovenstaande getrakteerd cellijnen (HepG2, HK2 en HCAECs) met geoptimaliseerde concentraties van Dynasore of rPCSK9 voorafgaand aan de toestroom bepaling vermeld. Onze resultaten toonden dat alle drie geteste cellijnen gereageerd op de behandelingen met aanzienlijke verlagingen in de LDL instroom in een 4-uur loop (Figuur 2). Bijvoorbeeld bij 4.33 h als het punt van de laatste keer, behandeling met Dynasore op 40 µM aanzienlijk verminderd LDL toestroom in HepG2 cellen, HK2 cellen en HCAECs door 53, 68% tot 54%, respectievelijk (p < 0,0001; Figuur 2 A-C en Tabel 2A-C). Daarnaast rPCSK9 bij 10 µg/mL veroorzaakt een duidelijke vermindering van 55% in LDL toestroom in HK2 cellen (p < 0,0001; Figuur 2 B en tabel 2B). Onze bevindingen bleek bovendien dat behandeling van HepG2 cellen met Simvastatin in een aanzienlijke stijging LDL opname (Figuur 3) resulteerde, ter ondersteuning van de gevoeligheid van deze methode voor het detecteren van belangrijke wijzigingen in de LDL-instroom. Studies van behandeling met rPCSK9 in HepG2 en HCAEC cellen zijn niet opgenomen in dit protocol als rPCSK9 wordt gebruikt als een extra controle behandeling met goed gedocumenteerde resultaten, maar is duur om te kopen in kleine hoeveelheden. RPCSK9 werd daarom alleen gebruikt voor het valideren van dit protocol in HK2 cellen.
Levende cel imaging analyse, samen met de functionele en tijdige meting van LDL toestroom, toegestaan voor het continue monitoring van de gezondheid en de morfologie van de cellen. Dit voordeel kan efficiënt mogelijke cytotoxiciteit van de toegepaste verbindingen, waardoor deze methode een ideale techniek voor gelijktijdig toezicht farmacologische activiteit en cytotoxiciteit detecteren. Cijfers 5-7 illustreren representatieve beelden van de drie geteste cellijnen aan het definitieve eindpunt (4.33 h) als een visuele referentie voor het effect van de behandelingen op de netto instroom van de LDL en toont ook de gezonde morfologie van de cellen na de geteste behandelingen. Wij raden de visuele inspectie van alle afbeeldingen van elk putje te verzekeren van de Heide morfologie van de cellen voor de duur van de studie. Bijvoorbeeld in de gegevens niet weergegeven, wanneer de beelden van HepG2 cellen met 80 μM behandeld Dynasore werden geïnspecteerd, we aanwijzingen van mobiele-detachement waargenomen zoals de randen van de cellen leek te worden opstijgen van de plaat, suggereren mobiele-Detachement bij de hogere concentraties van Dynasore. Bovendien, hoge concentraties van simvastatine (3-10 μM) ook geleid tot een gewijzigde morfologie die aangeeft veroorzaakte apoptosis zoals gemeld voor hoge doseringen van statines45. Dit protocol werd gebruikt voor het uitvoeren van een titratie van de behandeling van de Dynasore bij 20-80 μM, en Simvastatin bij 0.5-10 μM concentratie, waarna de cel-beelden werden gebruikt voor het analyseren van de gezondheid van de cellen en bepalen potentiële ctotoxicity van de behandelingen op verschillende concentraties. Resultaten voorgesteld het gebruik van 40 μM voor Dyansore en 1 μM voor simvastatine als optimale concentraties.
Tot slot, is het raadzaam een cel dichtheid titratie studie uitvoeren als een andere cellijn wil met deze methode worden getest teneinde de optimale celaantal per putje om consistente resultaten te verkrijgen. Onze cel dichtheid optimalisatie studie toonde aan dat 10.000 cellen per putje in een 24-well-plate tot consistente resultaten van de toestroom van de LDL voor HK2 en HCAE cellen leiden. Het is belangrijk op te merken dat voor deze LDL toestroom assay met behulp van levende cellen imaging systeem, een monolayer van niet-heuvels cellen gelijkmatig verdeeld op de putten wenselijk is aangezien bosjes van cellen aanleiding tot fouten in de genormaliseerde LDL toestroom resultaatwaarden geven kunnen. De reden hiervoor is dat voor de normalisatie van de gegevens van de toestroom, de fase-objectgebied wordt gebruikt als een maatregel van de celdichtheid en deze parameter nadelig kan worden beïnvloed wanneer cel bosjes worden gevormd. We hebben vastgesteld dat cellen van de HepG2 hebben de neiging om vorm bosjes wanneer ontpit op dichtheid hoger dan 5.000 cellen per putje waardoor inconsistente toestroom resultaten; Dus, we gebruikten 5.000 cellen per putje in een 24-well-plate als optimale dichtheid voor HepG2 cellen.
Collectief, biedt onze methode een medium tot hoge doorvoer-platform voor het screenen van de farmacologische activiteit en de cytotoxiciteit van verbindingen LDL toestroom gelijktijdig te reguleren. Deze methode kan worden gemakkelijk aangepast voor gebruik met andere fluorescently-geëtiketteerden liganden die worden ingevoerd door de lysosomale compartiment te evalueren ligand opname in real-time. Terwijl dit protocol biedt specificaties voor InCucyte leven beeldvorming en analysesysteem, het protocol kan worden aangepast voor alternatieve imaging systemen zoals Cellomics.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan LAS: National Institute of Health (R56HL132209 en 1R01HL140468) en het onderzoeksinstituut voor hart van Miami. KY is een ontvanger van de American Heart Association predoctoraal Fellowship (18PRE33960070). HepG2 cellen werden beschikbaar gesteld door Dr Emmanuel Thomas, Universiteit van Miami-Miller School van geneeskunde46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |