Summary

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Abstract

La inmunofluorescencia es una técnica bien establecida para la detección de antígenos en los tejidos con el empleo de anticuerpos conjugados con fluorocromo y tiene un amplio espectro de aplicaciones. Detección de antígenos permite la caracterización y la identificación de múltiples tipos de células. Situado por encima de los riñones y encapsulado por una capa de células mesenquimales, la glándula suprarrenal es un órgano endocrino, compuesto por dos tejidos diferentes con diferente origen embriológico, la corteza externa de derivados del mesodermo intermediaria mesonephric y los nervios médula interna derivados de la cresta. La corteza suprarrenal segrega esteroides (es decir, mineralocorticoides, glucocorticoides, hormonas sexuales), mientras que la médula suprarrenal produce las catecolaminas (es decir, adrenalina, noradrenalina). Mientras realiza la investigación suprarrenal, es importante poder distinguir células únicas con diferentes funciones. Aquí proporcionamos un protocolo desarrollado en nuestro laboratorio que describe una serie de pasos secuenciales necesarios para obtención de tinción de inmunofluorescencia para caracterizar los tipos celulares de la glándula suprarrenal. Nos centramos primero en la disección de las glándulas suprarrenales de ratón, la eliminación microscópica del periadrenal grasa seguida de la fijación, la transformación y la inclusión en parafina de los tejidos. A continuación describimos de seccionamiento de los bloques de tejido con un micrótomo rotatorio. Por último, detallamos un protocolo para la tinción inmunofluorescente de las glándulas suprarrenales que hemos desarrollado para minimizar la Unión inespecífica del anticuerpo y autofluorescencia para obtener una señal óptima.

Introduction

Inmunohistoquímica es una técnica para la detección de componentes del tejido con el uso de anticuerpos contra moléculas celulares específicas y posteriores técnicas de tinción para detectar los anticuerpos conjugados1. Este procedimiento de inmunohistoquímica requiere fijación específica y procesamiento de los tejidos que están determinados a menudo empírico para el antígeno específico, tejidos y anticuerpos utilizados2. La fijación es crucial para preservar el estado “original” de los tejidos y manteniendo así intacta celular y estructuras subcelulares y patrones de expresión. Se necesitan adicionales de procesamiento y procedimientos de inclusión para preparar el tejido seccionado en rebanadas que se usan para estudios histológicos con inmunohistoquímica.

Inmunotinción puede realizarse con detección chromogenic o fluorescente. Detección cromógena requiere la utilización de una enzima para convertir un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble. Mientras que esta enzima puede ser conjugada con el anticuerpo reconoce al antígeno (anticuerpo primario), más a menudo es conjugado con el anticuerpo que reconoce el anticuerpo primario (es decir, el anticuerpo secundario). Esta técnica es muy sensible; el producto coloreado que resultan de la reacción enzimática es Fotoestables y requiere sólo un microscopio de campo luminoso para la proyección de imagen. Sin embargo, immunostaining cromogénico puede no ser conveniente cuando se intenta visualizar dos proteínas que co localización, ya que la deposición de un solo color puede enmascarar la deposición de la otra. En el caso de coloración Co, inmunofluorescencia ha demostrado para ser más ventajosos. El advenimiento de la inmunofluorescencia se atribuye a Albert Coons y colegas, que desarrolló un sistema para identificar antígenos de tejidos con anticuerpos marcados con fluoresceína y visualizarlas en los tejidos seccionados bajo luz ultravioleta3. Detección de fluorescencia se basa en un anticuerpo conjugado con un fluoróforo que emite luz después de la excitación. Porque hay varios fluoróforos con emisiones en diferentes longitudes de onda (con poca o ninguna superposición), este método de detección es ideal para los estudios de múltiples proteínas.

La glándula suprarrenal es un órgano vinculado situado encima del riñón y caracterizado por dos componentes embriológicamente distintos rodeados por una cápsula mesenquimal. La corteza suprarrenal externa, derivada del mesodermo intermedio mesonephric, secretan hormonas esteroides mientras que la médula interna, derivada de la cresta neural, produce catecolaminas como adrenalina, noradrenalina y dopamina. La corteza suprarrenal se divide histológicamente y funcionalmente en tres zonas concéntricas, con cada zona secretoras de diferentes clases de hormonas esteroides: el exterior de la zona glomerular (zG) produce mineralocorticoides que regulan la homeostasis de electrolitos y volumen intravascular; la media de la zona fasciculada (zF), directamente debajo de la zG, segrega glucocorticoides que median la respuesta de estrés a través de la movilización de los almacenes de la energía para aumentar la glucosa en plasma; y la zona interna reticular (zR), que sintetiza precursores de esteroides (es decir, dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.

Alguna variación en la zonación adrenocortical está presente entre las especies: por ejemplo, Mus musculus carece de la zR. La única zona X postnatal del M. musculus es un remanente de la corteza fetal caracterizado por pequeñas células pobres en lípidos con citoplasmas acidófilos5. La zona X desaparece en la pubertad en ratones machos y después del primer embarazo en ratones femeninos o degenera gradualmente en las hembras no crían6,7. Por otra parte, la tortuosidad y el espesor de los objetos expuestos de zG marcan variación entre las especies como la organización de las células madre y progenitoras periféricas en y adyacente a la zG. La rata, a diferencia de otros roedores, dispone de una zona indiferenciada visible (zU) entre la zG y zF que funciona como una zona de la célula de vástago o una zona de transitorios amplificando progenitores. El zU es único a las ratas o simplemente más prominente organizan grupo de células es desconocido8,9.

Las células de la corteza suprarrenal contienen gotitas de lípidos que almacenan los ésteres de colesterol que servir como el precursor de todas las hormonas esteroides10,11.  El término “steroidogenesis” define el proceso de producción de las hormonas esteroides de colesterol a través de una serie de reacciones enzimáticas que involucran la actividad del factor steroidogenic 1 (SF1), cuya expresión es un marcador de potencial steroidogenic. En la glándula suprarrenal, Sf1 expresión sólo está presente en las células de la corteza12. Un interesante estudio encuentra la expresión de la biotina endógena en las células adrenocorticales con potencial steroidogenic13. Mientras que esto puede ser la causa de una mayor experiencia en métodos de tinción basada en biotina/estreptavidina, debido a la detección de la biotina endógena por el anticuerpo conjugado con estreptavidina, esta característica podría emplearse también para distinguir el steroidogenic células de otras poblaciones dentro de la glándula suprarrenal, es decir, endoteliales, capsular y las células de la médula.

Inervado por neuronas simpáticas preganglionares, la médula suprarrenal se caracteriza por células basófilas con un citoplasma granular que contiene epinefrina y norepinefrina. Las células de la médula se denominan “cromafines” debido al alto contenido de catecolaminas que forma un pigmento marrón después de oxidación14. Tirosina hidroxilasa (TH) es la enzima que cataliza el paso tarifa-limitador en la síntesis de catecolaminas y en la glándula suprarrenal, se expresa solamente en la médula15.

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón, su proceso de inclusión en parafina de seccionamiento y un método para realizar la inmunofluorescencia que manchaba en suprarrenales secciones con el fin de identificar los tipos celulares que constituyen el corteza suprarrenal y la médula. Este protocolo es un estándar en nuestro laboratorio para la inmunotinción con anticuerpos múltiples rutinariamente utilizados en nuestra investigación.

Protocol

Todos los métodos fueron realizados según protocolos aprobados institucionalmente bajo el auspicio de la Comisión de la Universidad sobre el uso y cuidado de animales en la Universidad de Michigan. 1. preparación para la cirugía El día antes de la cirugía, preparar 4% paraformaldehido (PFA) / fosfato tampón salino (PBS). En el caso de alícuotas congeladas, proceder a descongelar uno y almacenar a 4 ° C.Nota: 4% PFA no es estable por más de 48 h.PRECAUCIÓN: PFA es …

Representative Results

La figura 1 representa un esquema del protocolo completo descrito anteriormente. Las glándulas suprarrenales son extraídas de ratones, tejido adiposo adyacente se quita con un microscopio de disección y el suprarrenal entonces se fijan en el 4% PFA. Después de este paso, las glándulas suprarrenales son procesadas embebidas en parafina y seccionadas con un micrótomo para cortar el órgano en rodajas finas que se depositan sobre los portaobjetos de micros…

Discussion

Este protocolo describe un método para el aislamiento de las glándulas suprarrenales de ratón junto con la preparación y tinción de las glándulas suprarrenales seccionado ratón embebido en parafina.

Comparado con otros protocolos que hemos probado, este protocolo de la inmunofluorescencia ha sido conveniente para la mayoría de los anticuerpos utilizados en nuestro laboratorio. Sin embargo, en algunos casos puede requerir algunos ajustes para mejorar los resultados de la tinción. Una v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias por sus sugerencias y asistencia técnica en el establecimiento de este protocolo Dr. Mohamad Zubair. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón, institutos nacionales de salud Research Grant 2R01-DK062027 (para G.D.H).

Materials

24-well cell culture plate Nest Biotechnology Co. 0412B
Disposable needles 25Gx5/8" Exel International 26403
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich  P6148
Paraplast plus  McCormik scientific 39502004 Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid Thermo scientific 1001097 Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades Accu-Edge 4685 Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds Polysciences Inc. 18986 Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15 75x25x1 mm
Xylene Fisher Chemical X5P1GAL 
200 Proof Ethanol Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads  Certified Safety Mfg, Inc 231-210 3"x3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit  Vector laboratories BMK-2202 For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes Kimtech 34155 Wipes 4.4×8.4 inch
Super PAP PEN Invitrogen  00-8899 Pen to draw on slides
Microscope cover glass  Fisherbrand 12-544-D Size: 22x50x1.5
DAPI Sigma D9542  (Prepared in 20mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent Molecular Probes P36930 Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q Lumen Dynamics Light source
Coolsnap Myo Photometrics Camera
Optiphot-2  Nikon Microscope
microtome Americal Optical
Tissue embedder Leica EG1150 H 
Tissue processor  Leica ASP300S
Normal goat serum Sigma G9023
Mouse anti-TH Millipore MAB318 Primary antibody
Rabbit anti-SF1 Ab proteintech group (PTGlabs)  custom made Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat Jackson ImmunoResearch 115-545-003  Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat Jackson ImmunoResearch 111-505-003 Secondary antibody
Citrate acid anhydrous Fisher Chemical A940-500
NIS-Elements Basic Research  Nikon Software for imaging

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  4. Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  5. Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
  6. Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
  7. Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
  8. Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
  9. Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
  10. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  11. Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
  12. Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
  13. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  14. Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
  15. Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
  16. Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
  17. Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
  18. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  19. Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
  20. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
  21. Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
  22. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  23. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).

Play Video

Cite This Article
Finco, I., Hammer, G. D. Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands. J. Vis. Exp. (140), e58530, doi:10.3791/58530 (2018).

View Video