Summary

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Qui presentiamo un metodo per isolare ghiandole surrenali da topi, difficoltà i tessuti, sezione loro ed eseguire la colorazione di immunofluorescenza.

Abstract

L’immunofluorescenza è una tecnica affermata per il rilevamento degli antigeni nei tessuti con l’impiego di anticorpi coniugati fluorocromo e ha un ampio spettro di applicazioni. Rilevamento degli antigeni permette per la caratterizzazione ed identificazione di più tipi di cellule. Situato sopra i reni e incapsulati da uno strato di cellule mesenchimali, il surrene è un organo endocrino, composto da due tessuti differenti con differenti origini embriologiche, mesonephric intermedia derivati mesoderma corteccia esterna e neurali derivati dalla cresta midollo interno. La corteccia surrenale secerne steroidi (cioè, i mineralcorticoidi, glucocorticoidi, ormoni sessuali), mentre il midollo surrenale produce catecolamine (cioè, adrenalina, noradrenalina). Durante lo svolgimento di ricerca adrenale, è importante essere in grado di distinguere le uniche cellule con funzioni diverse. Qui forniamo un protocollo sviluppato nel nostro laboratorio che descrive una serie di passi sequenziali necessarie per ottenere la colorazione di immunofluorescenza per caratterizzare i tipi di cellule della ghiandola surrenale. Prima ci concentriamo sulla dissezione delle ghiandole surrenali del mouse, la rimozione microscopica del grasso di periadrenal seguita dalla fissazione, elaborazione e inclusione in paraffina del tessuto. Descriviamo quindi la divisione dei blocchi di tessuto con un microtomo rotativo. Infine, abbiamo dettaglio un protocollo per la macchiatura immunofluorescente delle ghiandole adrenali che abbiamo sviluppato per ridurre al minimo sia non specifico anticorpo che lega e autofluorescenza al fine di ottenere un segnale ottimo.

Introduction

Immunohistochemistry è una tecnica per la rilevazione di componenti del tessuto con l’uso di anticorpi contro specifiche molecole cellulari e successive tecniche di colorazione per rilevare gli anticorpi coniugati1. Questa procedura di immunohistochemical richiede particolare attenzione e il trattamento dei tessuti che sono spesso empiricamente determinati per l’antigene specifico, dei tessuti e l’anticorpo utilizzato2. La fissazione è cruciale per mantenere lo stato “originale” del tessuto e quindi mantenendo intatto cellular e strutture subcellulari e modelli di espressione. Ulteriore elaborazione e incorporare procedure necessari per preparare il tessuto per il taglio a fettine sottili che vengono utilizzati per gli studi istologici che coinvolgono immunohistochemistry.

Immunostaining può essere eseguita con rilevamento o cromogenico o fluorescente. Cromogenico rilevamento richiede l’utilizzo di un enzima per convertire un substrato solubile in un prodotto colorato insolubile. Mentre questo enzima può essere coniugato all’anticorpo riconosce l’antigene (anticorpo primario), esso è più spesso coniugata con l’anticorpo che riconosce l’anticorpo primario (cioè, l’anticorpo secondario). Questa tecnica è altamente sensibile; il prodotto colorato risultante dalla reazione enzimatica è fotostabile e richiede solo un microscopio a campo chiaro per l’imaging. Tuttavia, cromogenico immunostaining può non essere adatto quando si tenta di visualizzare due proteine che co-localizzano, poiché la deposizione di un colore può mascherare la deposizione di altro. In caso di co-macchiatura, immunofluorescenza ha dimostrato di essere più vantaggioso. L’avvento dell’immunofluorescenza è attribuita a Albert Coons e colleghi, che ha sviluppato un sistema per identificare gli antigeni del tessuto con anticorpi marcati con fluoresceina e visualizzarli nei tessuti sezionati sotto luce ultravioletta3. Rilevazione della fluorescenza è basato su un anticorpo coniugato con un fluoroforo che emette luce dopo l’eccitazione. Poiché esistono diversi fluorofori con emissioni a lunghezze d’onda (con poca o nessuna sovrapposizione), questo metodo di rilevamento è ideale per gli studi di molte proteine.

Il surrene è un organo accoppiato situato sopra il rene e caratterizzato da due componenti embriologicamente distinte, circondate da una capsula mesenchymal. Corteccia surrenale esterna, derivata dal mesoderma intermedio mesonefrici, secerne ormoni steroidei, mentre il midollo interno, derivato dalla cresta neurale, produce le catecolamine tra cui adrenalina, noradrenalina e dopamina. La corteccia surrenale è istologicamente e funzionalmente suddiviso in tre zone concentriche, con ogni zona che secernono diverse classi di ormoni steroidei: l’esterno zona glomerulare (zG) produce mineralcorticoidi che regolano l’omeostasi dell’elettrolito e volume intravascolare; la centrale zona fascicolata (zF), direttamente sotto il zG, secerne i glucocorticoidi che mediano la risposta allo stress attraverso la mobilitazione delle riserve di energia per aumentare il glucosio del plasma; e i reticularis di zona interna (zR), che sintetizza il sesso precursori steroidei (cioè, del deidroepiandrosterone (DHEAS))4.

Qualche variazione nella zonazione corticosurrenale è presente tra le specie: per esempio, Mus musculus manca la zR. X-zone postnatale unica di M. musculus è un residuo della corteccia fetale caratterizzata da piccole cellule lipido-poveri con acidofilico citoplasmi5. X-zone scomparirà alla pubertà nei topi maschi e dopo la prima gravidanza nei topi femmina, o gradualmente degenera in femmine di razza non6,7. Inoltre, la tortuosità e lo spessore delle esposizioni zG segnato variazione tra le specie come organizzazione delle cellule staminali e progenitori periferiche in ed adiacente la zG. Il ratto, a differenza di altri roditori, ha una zona indifferenziata visibile (zU) tra il zG e zF che funzioni come una zona di cellule staminali e/o una zona del transiente amplificando progenitori. Se il zU è unica ai ratti o semplicemente un più prominente organizzato aggregato di cellule è sconosciuto8,9.

Le cellule della corteccia surrenale contengono goccioline lipidiche contenenti esteri del colesterolo che servono come il precursore di tutti gli ormoni steroidei10,11.  Il termine “steroidogenesi” definisce il processo di produzione di ormoni steroidei dal colesterolo tramite una serie di reazioni enzimatiche che coinvolgono l’attività del fattore steroidogenico 1 (SF1), la cui espressione è un indicatore del potenziale steroidogenic. Nella ghiandola adrenale, Sf1 espressione è presente solo nelle cellule della corteccia12. Un interessante studio ha trovato l’espressione di biotina endogena in cellule corticosurrenali con potenziali steroidogenic13. Mentre questo può essere la causa di un più elevato background in metodi di colorazione biotina/streptavidina-base, a causa del rilevamento di biotina endogena di anticorpo coniugato con streptavidina, questa caratteristica potrebbe essere impiegata anche per distinguere il steroidogenic cellule da altre popolazioni all’interno della ghiandola surrenale, cioè, endoteliale, capsulare e cellule di midollo.

Innervati dai neuroni preganglionic simpatici, il midollo surrenale è caratterizzato da cellule basophilic con un citoplasma granulare contenente epinefrina e norepinefrina. Cellule di midollo sono denominate “cromaffine” grazie all’elevato contenuto di catecolamine che formano un pigmento marrone dopo ossidazione14. Tirosina idrossilasi (TH) è l’enzima che catalizza la tappa limitante della sintesi delle catecolamine e, nella ghiandola adrenale, è espresso solo nel midollo15.

Qui presentiamo un protocollo per l’isolamento delle ghiandole surrenali di mouse, loro elaborazione per l’incorporamento in paraffina e sezionamento e un metodo per eseguire immunofluorescenza su sezioni adrenale di colorazione al fine di identificare i tipi cellulari che costituiscono il corteccia surrenale e nel midollo. Questo protocollo è uno standard nel nostro laboratorio per immunostaining con gli anticorpi più abitualmente utilizzati nella nostra ricerca.

Protocol

Tutti i metodi sono stati effettuati secondo protocolli istituzionalmente approvati sotto gli auspici del Comitato Università sull’uso e la cura degli animali presso l’Università del Michigan. 1. preparazione per la chirurgia Il giorno prima dell’intervento chirurgico, preparare la paraformaldeide al 4% (PFA) / tampone fosfato salino (PBS). In caso di aliquote congelate, procedere a scongelare uno e conservare a 4 ° C.Nota: 4% PFA non è stabile per più di 48 h.Attenzione…

Representative Results

Figura 1 rappresenta lo schema dell’intero protocollo descritto in precedenza. Ghiandole surrenali vengono raccolte dai topi, tessuto adiposo adiacente viene rimosso sotto un microscopio per dissezione e adrenale sono fissate in 4% PFA. Dopo questo passaggio, le ghiandole surrenali sono elaborate e inclusi in paraffina e sezionate con un microtomo per tagliare l’organo in fette sottili che si depositano su vetrini da microscopio. Dopo l’essiccazione delle sez…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per l’isolamento delle ghiandole surrenali del mouse insieme con la preparazione e colorazione delle ghiandole surrenali sezionato paraffina-incastonato del mouse.

Rispetto ad altri protocolli che abbiamo testato, questo protocollo di immunofluorescenza ha dimostrato adatto per la maggior parte degli anticorpi utilizzati nel nostro laboratorio. Tuttavia, in alcuni casi può richiedere qualche aggiustamento per migliorare i risultati di colorazione. Una vari…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Mohamad Zubair per i suoi utili suggerimenti e assistenza tecnica alla creazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Diabetes e digerente e malattie renali, istituti nazionali di salute Research Grant 2R01-DK062027 (per Gallucci).

Materials

24-well cell culture plate Nest Biotechnology Co. 0412B
Disposable needles 25Gx5/8" Exel International 26403
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich  P6148
Paraplast plus  McCormik scientific 39502004 Paraffin for tissue embedding
Shandon biopsy cassettes II with attached lid Thermo scientific 1001097 Cassettes for tissue processing
High Profile Microtome Blades Accu-Edge 4685 Disposable stainless steel blades
Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds Polysciences Inc. 18986 Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15 75x25x1 mm
Xylene Fisher Chemical X5P1GAL 
200 Proof Ethanol Decon Labs, Inc.
Certi-Pad Gauze pads  Certified Safety Mfg, Inc 231-210 3"x3. Sterile latex free gauze pads
M.O.M kit  Vector laboratories BMK-2202 For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue
KimWipes Kimtech 34155 Wipes 4.4×8.4 inch
Super PAP PEN Invitrogen  00-8899 Pen to draw on slides
Microscope cover glass  Fisherbrand 12-544-D Size: 22x50x1.5
DAPI Sigma D9542  (Prepared in 20mg/mL stock)
ProLong Gold antifade reagent Molecular Probes P36930 Mounting agent for immunofluorescence
X-cite series 120Q Lumen Dynamics Light source
Coolsnap Myo Photometrics Camera
Optiphot-2  Nikon Microscope
microtome Americal Optical
Tissue embedder Leica EG1150 H 
Tissue processor  Leica ASP300S
Normal goat serum Sigma G9023
Mouse anti-TH Millipore MAB318 Primary antibody
Rabbit anti-SF1 Ab proteintech group (PTGlabs)  custom made Primary antibody
Alexa-488 Mouse IgG  raised goat Jackson ImmunoResearch 115-545-003  Secondary antibody
Dylight-549 Rabbit IgG raised goat Jackson ImmunoResearch 111-505-003 Secondary antibody
Citrate acid anhydrous Fisher Chemical A940-500
NIS-Elements Basic Research  Nikon Software for imaging

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
  2. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  3. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  4. Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  5. Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
  6. Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
  7. Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, 120-126 (1972).
  8. Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
  9. Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
  10. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
  11. Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
  12. Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
  13. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  14. Lowe, J., Anderson, P. . Stevens & Lowe’s Human Histology, 4th Edition. , 263-285 (2015).
  15. Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
  16. Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
  17. Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
  18. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  19. Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
  20. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
  21. Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
  22. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  23. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).

Play Video

Cite This Article
Finco, I., Hammer, G. D. Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands. J. Vis. Exp. (140), e58530, doi:10.3791/58530 (2018).

View Video