Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode, um die Nebennieren von Mäusen zu isolieren, das Gewebe zu beheben, sie Abschnitt und durchführen Immunfluoreszenz-Färbung.
Abstract
Immunfluoreszenz ist eine etablierte Methode zur Erkennung von Antigenen in Geweben mit der Beschäftigung von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern und verfügt über ein breites Spektrum an Anwendungen. Erkennung von Antigenen ermöglicht die Charakterisierung und Identifizierung von mehreren Zelltypen. Oberhalb der Nieren und durch eine Schicht von mesenchymalen Zellen eingekapselt, ist der Nebenniere eine endokrine Organ, bestehend aus zwei verschiedenen Geweben mit unterschiedlicher embryologischen Herkunft, der mesonephric mittlere Mesoderm abgeleitet äußere Rinde und der neuronalen Kamm-abgeleiteten inneren Medulla. Die Nebennierenrinde sondert Steroide (d. h. Mineralocorticoids, Glukokortikoide, Sexualhormone), während das Nebennierenmark Katecholamine (z.B. Adrenalin, Noradrenalin) produziert. Während der Nebennieren forschen, ist es wichtig, einzigartige Zellen mit unterschiedlichen Funktionen unterscheiden zu können. Hier bieten wir ein Protokoll entwickelt, die in unserem Labor, das beschreibt eine Reihe von aufeinander folgenden Schritten erforderlich für den Erhalt der Immunfluoreszenz-Färbung, die Zelltypen der Nebenniere zu charakterisieren. Wir konzentrieren uns zunächst auf die Zerlegung der Nebennieren Maus die mikroskopische Entfernung von Periadrenal Fett, gefolgt von der Fixierung, die Verarbeitung und das Paraffin Einbettung des Gewebes. Wir beschreiben der Gewebe Blöcke mit einer rotierenden Mikrotom schneiden. Zu guter Letzt zeigen wir ein Protokoll für immunofluorescent Färbung der Nebennieren, die wir entwickelt haben, um unspezifische Antikörperbindung und Autofluoreszenz zu minimieren, um ein optimales Signal zu erreichen.
Introduction
Immunohistochemistry ist eine Technik zur Erkennung von gewebeanteile mit dem Einsatz von Antikörpern gegen spezifische zelluläre Moleküle und anschließende befleckenden Techniken der konjugierten Antikörpern1zu erkennen. Diese immunhistochemische Verfahren erfordert spezielle Fixierung und Verarbeitung von Geweben, die für das Antigen oft empirisch ermittelt werden, Gewebe und Antikörper verwendet2. Die Fixierung ist entscheidend für den “ursprünglichen” Zustand des Gewebes und damit Erhaltung intakten zellulären und subzellulären Strukturen und Expressionsmuster beizubehalten. Weitere sind Verarbeitung und Einbettung Verfahren erforderlich, um das Gewebe vorbereiten, schneiden in dünne Scheiben schneiden, die histologische Studien mit Immunohistochemistry verwendet werden.
Immunostaining kann mit chromogenen oder fluoreszierende Erkennung durchgeführt werden. Chromogene Erkennung erfordert die Verwendung eines Enzyms zu einem löslichen Substrat in eine unlösliche farbige Produkt umzuwandeln. Während dieses Enzym an der Antikörper erkennt das Antigen (Primärantikörper) konjugiert werden kann, ist es immer öfter an den Antikörper erkennen den primären Antikörper (d.h. der Sekundärantikörper) konjugiert. Diese Technik ist sehr empfindlich; Das farbige Produkt aus der enzymatischen Reaktion ist Photostabil und erfordert nur ein Hellfeld-Mikroskop für die Bildgebung. Jedoch kann chromogenen Immunostaining nicht geeignet wenn Sie versuchen, zwei Proteine zu visualisieren, die Co lokalisieren, da die Abscheidung einer Farbe kann die Ablagerung des anderen Maske. Im Falle von Co Färbung, hat Immunfluoreszenz mehr als vorteilhaft erwiesen. Das Aufkommen der Immunfluoreszenz wird zugeschrieben Albert Coons und Kollegen, die ein System zur Identifizierung von Gewebe-Antigene mit Antikörpern mit Fluorescein gekennzeichnet und visualisieren im geschnittenen Gewebe unter ultraviolettem Licht3entwickelt. Fluoreszenz-Detektion basiert auf einem Antikörper konjugiert mit einem Fluorophore, die nach Anregung Licht ausstrahlt. Da gibt es mehrere Fluorophore mit Emissionen bei verschiedenen Wellenlängen (mit keine oder nur geringe Überlappung), eignet sich diese Nachweismethode für die Studien von mehreren Proteinen.
Die Nebenniere ist ein gekoppelten Organ befindet sich oberhalb der Niere und zeichnet sich durch zwei embryologically verschiedene Komponenten von mesenchymalen Kapsel umgeben. Die äußeren Nebennierenrinde, abgeleitet von der mesonephric mittlere Mesoderm sondert Steroidhormone während die inneren Medulla, abgeleitet aus der Neuralleiste Katecholamine wie Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin produziert. Die Nebennierenrinde histologisch und funktional gliedert sich in drei konzentrische Zonen mit jeder Zone sezernierenden verschiedene Klassen von Steroid-Hormone: die äußeren Zona Glomerulosa (zG) produziert Mineralocorticoids, die Elektrolyt-Homöostase zu regulieren und intravasale Volumen; die mittlere Zona Fasciculata (zF), sondert direkt unterhalb der zG, Glukokortikoide, die die Stress-Reaktion durch die Mobilisierung der Energiespeicher Erhöhung der Plasma-Glukose zu vermitteln; und der inneren Zona Reticularis (zR), die synthetisiert sex Steroid Vorläufer (d. h. Dehydroepiandrosteron (DHEAS))4.
Einige Variationen in NNR Zonierung ist zwischen den Arten vorhanden: z. B. Mus Musculus fehlt der zR. Die einzigartige postnatale X-Zone des M. Musculus ist ein Überrest des fetalen Kortex zeichnet sich durch kleine Lipid-Armen Zellen mit acidophilen Cytoplasma5. Die X-Zone verschwindet in der Pubertät bei männlichen Mäusen und nach der ersten Schwangerschaft bei weiblichen Mäusen oder allmählich verkommt nicht gezüchtete Weibchen6,7. Darüber hinaus markiert die schlängelung und Dicke der zG Exponate Variation zwischen den Arten, wie Organisation von peripheren Stamm- und Vorläuferzellen in und neben der zG. Die Ratte, im Gegensatz zu anderen Nagetieren verfügt über eine sichtbare undifferenzierte Zone (zU) zwischen dem zG und zF funktioniert als eine Stammzell-Zone und/oder eine vorübergehende Verstärkung Stammväter-Zone. Ob die zU einzigartig für Ratten ist oder einfach mehr prominent Cluster von Zellen organisiert ist unbekannt8,9.
Zellen der Nebennierenrinde enthalten Lipid-Tröpfchen, die Cholesterin-Ester zu speichern, die als Vorläufer der alle Steroidhormone10,11dienen. Der Begriff “steroidgenese” definiert den Prozess der Produktion von Steroidhormonen aus Cholesterin über eine Reihe von enzymatischen Reaktionen, bei denen die Aktivität von steroidogenic Factor 1 (SF1), deren Ausdruck ein Marker für steroidogenic Potenzial ist. In der Nebenniere ist Sf1 Ausdruck nur in den Zellen der Hirnrinde12vorhanden. Eine interessante Studie fand den Ausdruck der endogene Biotin in NNR Zellen mit steroidogenic potenzielle13. Während dies kann die Ursache für einen höheren Hintergrund in Biotin/Streptavidin-basierte Färbung Methoden, durch die Erkennung von endogenen Biotin durch Antikörper konjugiert mit Streptavidin, könnte dieses Merkmal auch eingesetzt werden, um den steroidogenic unterscheiden Zellen aus anderen Populationen innerhalb der Nebenniere, d. h., Endothelzellen, Kapsel und Medulla Zellen.
Sympathische neuroendokrine Neuronen innerviert, zeichnet sich das Nebennierenmark durch basophile Zellen mit einem körnigen Zytoplasma, Adrenalin und Noradrenalin enthalten. Medulla Zellen sind aufgrund des hohen Gehaltes an Katecholaminen, die braunes Pigment nach Oxidation14 bilden“chromaffin” benannt. Tyrosin-Hydroxylase (TH) ist das Enzym das katalysiert die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der Synthese der Katecholamine und in der Nebenniere, äußert sich nur in der Medulla15.
Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung der Maus Nebennieren, deren Verarbeitung für die Einbettung in Paraffin-Schnitt und eine Methode durchzuführen Immunfluoreszenz-Färbung auf Nebennieren Abschnitte um die zelluläre Arten bilden die Nebennierenrinde und Medulla. Dieses Protokoll ist ein Standard in unserem Labor für Immunostaining mit mehreren Antikörpern routinemäßig in unserer Forschung verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Isolierung von Maus Nebennieren zusammen mit der Vorbereitung und Färbung der geschnittenen Paraffin-eingebetteten Maus Nebennieren.
Im Vergleich zu anderen Protokollen, die wir getestet, hat dieses Immunfluoreszenz-Protokoll für die meisten der in unserem Labor verwendeten Antikörper geeignet erwiesen. In bestimmten Fällen kann es jedoch, einige Anpassungen zur Verbesserung der Färbung Ergebnisse verlangen. Eine Variable, die leicht geän…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Mohamad Zubair für seine Anregungen und technische Hilfe bei der Schaffung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen, nationale Institute der Gesundheit Research Grant 2R01-DK062027 (zu G.D.H) unterstützt.
Materials
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25Gx5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated,22mm square top tapered to 12mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75x25x1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3"x3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4×8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22x50x1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | Americal Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
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