Medição de alto rendimento da membrana plasmática, efectuou a eficiência em células de mamíferos

Summary

Aqui nós descrevemos um alta produtividade baseada em fluorescência do ensaio que mede a membrana plasmática, efectuou a eficiência por meio de análises fluorométrica e da imagem latente em células vivas. Este ensaio pode ser usado para triagem de drogas ou genes-alvo que regulam a membrana plasmática de fechamento em células de mamíferos.

Abstract

Em seu ambiente fisiológico, células de mamíferos são frequentemente sujeitas a tensões mecânicas e bioquímicas que resultam em danos de membrana plasmática. Em resposta a esses danos, máquinas moleculares complexas rapidamente selar novamente a membrana plasmática para restaurar a sua função de barreira e manter a sobrevivência da pilha. Apesar de 60 anos de investigação neste domínio, ainda falta uma compreensão completa da célula máquinas de fechamento. Com o objetivo de identificar componentes celulares que controle de fechamento de membrana plasmática ou drogas que podem melhorar a recelagem, nós desenvolvemos um ensaio de alto rendimento baseada em fluorescência que mede a membrana plasmática recelagem eficiência em células de mamíferos cultivadas em microplacas. Como um sistema modelo para danos de membrana plasmática, as células estão expostas à bactérias formadoras de poros toxina listeriolisina O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diâmetro proteicas poros em colesterol, contendo membranas. O uso de um leitor de microplacas de modo multi temperatura controlada permite medições de spectrofluorometric rápida e sensível, em combinação com brightfield e imagem de microscopia de fluorescência das células vivas. Análise cinética da intensidade da fluorescência emitida pelo fluorocromo impermeant de ácido nucleico-ligação membrana reflete a extensão da membrana, ferindo e efectuou no nível da população de célula, permitindo o cálculo da célula eficiência de fechamento . Imagem de microscopia de fluorescência permite a enumeração de células, que constitutivamente expressa uma quimera fluorescente de 2B de histona a proteína nuclear, em cada poço do microplate em conta possíveis variações em seu número e permite a eventual identificação de populações de células distintas. Este ensaio de alto rendimento é uma ferramenta poderosa, espera-se expandir a nossa compreensão dos mecanismos de reparação de membrana através de triagem para genes do hospedeiro ou exogenamente adicionados compostos que efectuou de membrana plasmática de controle.

Introduction

Células de mamíferos estão sujeitos a estresse mecânico, osmótico e bioquímico, resultando na perda da integridade da membrana plasmática. Sem rápida e eficiente de fechamento, células danificadas rapidamente iria sucumbir à morte programada ou necrótica. Desde a década de 1960, os esforços para compreender a membrana de plasma nesse processo tem sido motivados pelas consequências devastadoras associadas com suas disfunções. Na verdade, doenças como Distrofia Muscular de membro-cinta, diabetes e síndrome de Chediak-Higashi têm sido associadas a reparação da membrana de plasma deficiente devido a mutações no gene dysferlin codificação, produção de produtos finais de glicação avançada e defeitos em o regulador de tráfico dos lisossomos CHS1, respectivamente,^1,2,3,4,5,6. No entanto, até à data, nossa compreensão da membrana de fechamento é ainda limitado⁷. Os estudos iniciais demonstraram que a membrana recelagem é iniciada pelo influxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana de plasma danificado^8,9,10. Desde então, vários não mutuamente exclusivas Ca^{2 +}-dependentes mecanismos têm sido propostos para selar as células. A hipótese de remendo propõe que no próximo a ferida, intracelulares vesículas fundem-se com os outros e a membrana plasmática danificada para atuar como um patch^11,12,13,14. Um segundo modelo propõe que exocitose de cálcio-dependente de lisossomos para a ferida local libera a enzima lisossomal sphingomyelinase ácido, que converte esfingomielina, a ceramida no folheto externo da membrana plasmática. Esta súbita mudança na composição de lipídios resulta em endocitose ceramida-conduzido a região danificada^15,16,17. Por último, o terceiro mecanismo proposto envolve um papel para o CDDP classificação complexa necessária para o transporte (ESCRT) promover a formação de vesículas virados que brote fora da membrana plasmática¹⁸. Somente um conjunto limitado de proteínas foi identificado nestes modelos, e suas máquinas devem ser ainda mais elucidada.

Aqui descrevemos um ensaio de alto rendimento que medidas a membrana plasmática recelagem eficiência em células de mamíferos aderentes sujeitos a danos mediadas por recombinação listeriolisina O (LLO)¹⁹. LLO é uma toxina formadoras de poros (PFT) secretada pelo patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes^20,21,22 e pertence a MACPF/CDC (complexo de ataque de membrana, perforina, e Superfamília Citolisina dependente de colesterol). MACPF são mamíferos poro-formando proteínas envolvidas em defesas imunitárias, Considerando que os conjuntos são toxinas bacterianas principalmente produziram por patógenos gram-positivos que danificam as células do hospedeiro para promover sua patogenicidade, estilos de vida²³. Conjuntos são sintetizados como monômeros Water-soluble ou dímeros que se ligam ao colesterol presente na membrana plasmática e oligomerize em um complexo prepore de até 50 subunidades. O complexo de prepore então se reorganiza para inserir β-vertentes através da bicamada lipídica, formando um poro do β-tambor que se estende por 30-50 nm de diâmetro^24,25,26,27.  Estes poros dilatados permitam fluxos de íons e pequenos componentes celulares dentro e fora da célula; no entanto, alguns estudos têm proposto que os poros de tamanhos menores também são formados^28,29,30. Entre os conjuntos, LLO exibe propriedades exclusivas, incluindo agregação irreversível e temperatura-dependente do pH, que é propício para análises de alta produtividade^31,32. LLO pode ser adicionado ao meio de cultura de células no 4 ˚ c, uma temperatura permissiva a sua ligação às células, mas não para a formação do complexo do poro. Iniciação de formação de poros então pode ser sincronizada, elevando a temperatura a 37 ˚ c, permitindo que pela difusão de moléculas de toxina no plano da membrana oligómeros de forma eficiente e para a remodelação conformacional envolvidos na geração de poros. Portanto, seguir o interruptor de temperatura, a cinética de danos celulares dependerá da quantidade de toxina ligada a membrana plasmática. Importante, LLO solúvel (não ligado a membrana plasmática) rápida e irreversivelmente agrega quando a temperatura atinge 37 ˚ c, que alivia a necessidade de lavar as moléculas da toxina não acoplado e limita a extensão dos danos de membrana ao longo do tempo. Por último, porque LLO vincula-se ao colesterol e forma poros nas membranas celulares ricos em colesterol, este ensaio é passível de uma ampla variedade de células de mamíferos. É importante ter em mente que LLO afeta a célula hospedeira sinalização principalmente através de formação de poros, com poucas exceções em qual célula independente de poro sinalização pode ocorrer^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Portanto, não pode ser excluído que LLO sinalização atividades podem influenciar o processo de reparação da membrana.

Este ensaio avalia diretamente a extensão da célula ferindo medindo-se a incorporação de uma célula impermeant fluorocromo (por exemplo, iodeto de propidium) que passivamente entra as células feridas e torna-se altamente fluorescente, uma vez que associa os ácidos nucleicos . Daí, o fluorocromo pode ser mantido em meio de cultura celular durante todo o experimento, permitindo análises em tempo real da célula ferindo. A intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-ligação aumentará a concentração de toxina e, para uma dada concentração de toxina, irá aumentar ao longo do tempo até que todos os poros são formados, e as células são totalmente reparadas ou até saturação é alcançada. O afluxo de extracelular Ca^{2 +} através da membrana poros é um evento de condição sine qua non para selar. Portanto, a eficiência de fechamento pode ser evidenciada indiretamente comparando a célula ferindo em meio de cultura contendo Ca^{2 +} (condição permissiva do reparo) para ferir em um Ca^{2 +}-livre médio (condição restritiva de reparação). Porque a intensidade da fluorescência do corante ácido nucleico-vinculação é diretamente proporcional à concentração de células em cada poço, é importante para as células de semente na mesma concentração em todos os poços. Também é importante enumerar as células em cada poço antes e após o ensaio para garantir que desprendimento celular não ocorre, como flutuante, agregados de células podem obscurecer as leituras de fluorescência que podem complicar a interpretação dos dados. Para enumerar as células, as células expressando nuclear-localizada histona 2B-GFP (H2B-GFP) foram utilizadas neste ensaio. Temperatura controlada, multi-modo, leitores de microplacas combinam rápidas medições, de alto rendimento (usando um formato de placa de 96 ou 384 poços) das intensidades de fluorescência com imagem de microscopia de células vivas, a 37 ° C. Este último pode ser usado para enumerar o número de telemóvel e observar a eventual formação de populações de células distintas.

Em última análise, este ensaio fornece aos usuários a capacidade de expandir seus conhecimentos sobre a complexidade dos mecanismos de reparação da membrana por triagem para moléculas do anfitrião ou reparar de forma exógena adicionados compostos que podem controlar a membrana. O protocolo a seguir descreve as etapas experimentais para medir a eficiência de fechamento de células expostas a LLO e avaliar os efeitos de uma determinada droga ou tratamento celular na eficiência de fechamento.

Protocol

1. preparação Chapeamento de célulaNota: Células epiteliais do colo do útero humanas, HeLa e HeLa expressando histona 2B-GFP (H2B-GFP), foram utilizadas neste protocolo, mas este ensaio pode ser adaptado a outras células de mamíferos,19. Separe células aderentes de um frasco de cultura de células de2 75cm lavando as células com 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Substitua a tripsina usada com 2 mL de fresco do trypsin-EDTA 0,25%. Incube as celulas em…

Representative Results

Célula, contando com precisão: as células HeLa são usadas frequentemente como uma linha de células de mamíferos do modelo para explorar mecanismos de reparação da membrana. Ao avaliar a reparação da membrana no nível da população de célula, é importante para as células da placa na mesma concentração em todos os poços para interpretação de dados apropriados. Também é importante verificar no momento do ensaio que celulares sejam equivalentes em poços. Células HeLa q…

Discussion

Este ensaio mede a eficiência da membrana efectuou a nível de população de células com capacidade de alta produtividade. Pode ser usada para triagem de bibliotecas de drogas que poderiam afetar a reparação da membrana ou componentes celulares. O ensaio descrito usado um formato de placa de 96 poços, mas pode ser adaptado para placas boas 384 para maior rendimento. Uma vantagem deste teste é sua capacidade de obter medidas de fluorescência das células vivas aderentes em tempo real sem a necessidade de célula e…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG