Summary

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

Abstract

그들의 생리 적인 환경에서 포유류 세포 원형질 막 손상 기계 및 생 화 확 적인 스트레스를 자주 받게 됩니다. 이러한 손해에 대응, 복잡 한 분자 기계는 빠르게 원형질 막의 장벽 기능 복원 및 세포 생존을 유지 다시 봉인. 이 분야에 있는 연구의 60 년에 불구 하 고 우리는 여전히 기계를 resealing 셀에 대 한 철저 한 이해 부족. 세포질 구성 요소를 식별 하는 목적으로 그 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 또는 resealing, 향상 시킬 수 있는 약물 개발 했습니다 플라즈마 멤브레인 resealing 포유류 세포에 있는 효율성을 측정 하는 형광 기반의 높은 처리량 분석 결과 microplates에서 경작. 원형질 막 손상에 대 한 모델 시스템으로 서 세포 세균 기 공 형성 독 소 listeriolysin O (LLO), 큰 30 ~ 50 nm 직경 배치할 포함 하는 콜레스테롤에 숨 구멍을 형성 하에 노출 되는 세포 막. 명시 및 살아있는 세포의 형광 현미경 이미지와 함께 신속 하 고 민감한 spectrofluorometric 측정 온도 제어 멀티 모드 microplate 리더를 사용 하 여 수 있습니다. 부상 및 효율 resealing 셀의 계산을 허용 세포 인구 수준 resealing 막의 정도 반영 하는 막 impermeant 핵 산 바인딩 형광 색소에 의해 방출 되는 형광 강도의 운동 분석 . 형광 현미경 영상 constitutively 핵 단백질 히스톤 2B 잠재적인 변화 그들의 수에 대 한 계정에 미 판의 각 우물에서의 형광 키메라를 표현 하 고 결국 세포의 열거 허용 뚜렷한 세포 인구의 식별입니다. 이 높은 처리량 분석 결과 호스트 유전자에 대 한 심사를 통해 막 복구 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 확장 하는 것으로 예상 된다 또는 것 추가 하는 강력한 도구는 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 화합물 이다.

Introduction

포유류 세포 원형질 막 무결성의 손실의 결과로 기계, 삼 투, 및 생 화 확 적인 스트레스를 받습니다. 신속 하 고 효율적인 resealing 없이 손상 된 세포는 신속 하 게 프로그램 또는 회 저 성 죽음에 굴복 하 고. 1960 년대 이후, 노력 과정 resealing 플라즈마 멤브레인을 이해 하는 엄청난 결과 장애와 관련 된 동기가 있다. 실제로, 사지 띠 근 위축 증, 당뇨병, 및 Chediak-히가시 증후군 같은 질병 돌연변이 유전자 인코딩 dysferlin, 고급 glycation 엔드 제품의 생산에서 및 결함 결핍 플라즈마 막 복구에 연결 되었습니다. lysosomal 밀매 레 귤 레이 터 CHS1, 각각1,2,,34,,56. 그러나, 날짜, 막의 우리의 이해를 resealing은 여전히 제한7입니다. 초기 연구는 세포 외 캘리포니아2 + 원형질 막 손상 된8,,910의 유입에 의해 시작 막 resealing 증명 하고있다. 그 이후, 여러 비 배타적이 캘리포니아2 +-종속 메커니즘 셀 봉인에 제안 되었습니다. 패치 가설 상처에 근접, 세포내 소포는 패치11,12,,1314로 손상 된 원형질 막 서로와 퓨즈를 제안 합니다. 두 번째 모델 제안 그 칼슘 의존 exocytosis 상처에서 리소좀의 사이트 해제 하는 lysosomal 효소 산 sphingomyelinase, 원형질 막의 외부 전단에서 세 라마 이드 sphingomyelin 변환. 지질 구성에서이 갑자기 변경 결과 손상 된 지역15,,1617의 세 라마 이드 기반 endocytosis. 마지막으로, 세 번째 제안 된 메커니즘 endosomal 정렬 복잡 한 전송 (ESCRT) 플라즈마 막18에서 떨어져 새싹 외부와 접한 vesicles의 형성을 촉진 하는 데 필요한에 대 한 역할을 포함 한다. 단백질의 제한 된 집합에 대해서만 이러한 모델에서 확인 된 그리고 그들의 기계를 더 해명 합니다.

여기 우리가 대책 resealing 효율 부착 포유류 세포에서 원형질 막 손상 받게 재조합 listeriolysin O (LLO)19에 의해 중재 높은 처리량 분석 결과 설명 합니다. LLO facultative 세포내 병원 체 Listeria monocytogenes20,,2122 분 비는 기 공 형성 독 (PFT) 이며 MACPF/CDC에 속한다 (막 공격 복합물, perforin, 그리고 콜레스테롤-종속 cytolysin) superfamily입니다. MACPF는 포유류 기 공 형성 단백질 반면 CDCs 세균성 독 소 주로 면역 방어에 관련 된 그들의 병원 성 생활23홍보 호스트 세포 손상 그람 양성 병원 균에 의해 생산. CDCs 수용 성 단위체로 합성 됩니다 또는 콜레스테롤을 바인딩할 이합체 플라즈마 멤브레인에 최대 50 subunits의 복잡 한 prepore에 oligomerize. Prepore 복잡 한 지질 bilayer, β 배럴 공 직경24,25,,262730-50 nm에 걸쳐 형성에서 β-가닥을 삽입할 다음 재정렬 합니다.  이러한 큰 모 공 세포;와 이온 및 작은 세포 구성 성분의 용 허용 하지만, 일부 연구는 작은 크기의 숨 구멍 형성된28,,2930도 제안 했다. CDCs, 가운데 LLO 높은 처리량 분석31,32에 도움이 되는 돌이킬 수 없는 pH 및 온도 의존 집계를 포함 한 독특한 속성을 표시 합니다. LLO 4 ˚C, 셀, 있지만 복잡 한 기 공 형성 수 없습니다 그것의 바인딩을 허용 온도에서 세포 배양에 추가 될 수 있습니다. 기 공 형성의 개시 다음 허용 양식 올리고 하 막의 비행기에 있는 독 소 분자의 효율적인 확산에 대 한 구조적 리 모델링에 대 한 기 공 생성에 관여 하는 37 ˚C를 온도 올려서 동기화 수 있습니다. 따라서, 온도, 세포 손상의 운동에 스위치에 따라 원형질 막에 바인딩된 독 소의 양을에 달라 집니다. 중요 한 것은, 녹는 LLO (원형질 막에 바인딩되지 않은) 신속 하 고 irreversibly 집계 온도 37 ˚C, 언바운드 독 소 분자를 멀리 세척 하는 필요를 완화 하 고 시간이 지남에 막 손상의 범위를 제한에 도달 하면. 마지막으로, LLO 콜레스테롤에 바인딩하고 콜레스테롤이 풍부한 세포 막에 있는 숨 구멍을 형성,이 분석 결과 이므로 다양 한 포유류 세포에 순종. LLO 호스트 셀 기 공 형성을 통해 주로 신호에 영향을 주는 다는 것을 명심 하는 것이 중요 하다는 기 공-독립 셀에 몇 가지 예외 신호33,,3435,36 발생할 수 있습니다 ,,3738,39. 따라서, 그것은 수 없습니다 그 LLO 활동 막 복구의 과정에 영향을 미칠 수 있습니다 신호를 제외.

이 분석 결과 직접 셀 한 셀 impermeant 형광 색소 (예를 들어, propidium 요오드 화물) 수 동적으로 상처 입은 세포를 입력 하 고 높은 형광 일단 핵 산으로 연결 되는의 설립을 측정 하 여 상처의 정도 평가 . 따라서, 허용 셀 부상의 실시간 분석 실험에 걸쳐 세포 배양에는 형광 색소를 유지할 수 있습니다. 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 독 소의 농도 증가 하 고, 독 소의 특정된 농도 대 한 것입니다 시간이 지남에 모든 숨 구멍 형성 되 고 세포는 완전히 수리 될 때까지 또는 증가 채도 도달할 때까지. 세포 외 캘리포니아2 + 막 숨 구멍을 통해 유입 resealing에 대 한 사인 qua 비 이벤트입니다. 따라서, resealing 효율 명시 될 수 있다 직접 하지 셀 부상 포함 된 캘리포니아2 + (수리 허용 조건)는 캘리포니아2 +에서 부상 하는 문화 매체에 비교 하 여-자유로운 매체 (수리 제한적인 조건). 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 각 음에 셀 농도에 직접 비례 하기 때문에 모든 우물에 같은 농도에서 종자 세포에 중요 하다. 그것은 또한 전후에 셀 분리 발생 하지 않습니다, 부동,으로 집계 셀 데이터 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다 하는 형광 읽기 애매 한 수 있도록 분석 결과 셀에 각 잘 열거 하는 것이 중요. 셀, 열거할 지역화 핵 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP)를 표현 하는 세포는이 분석 결과에서 사용 되었다. 온도 제어, 멀티 모드 microplate 리더 결합 형광 강렬의 급속 한, 높은 처리량 측정 (를 사용 하 여 96 또는 384-잘 플레이트 형식) 37 ° c.에 살아있는 세포의 현미경 이미징 후자는 휴대폰 번호를 열거 하 고 뚜렷한 세포 인구의 최종 형성 관찰을 사용할 수 있습니다.

궁극적으로,이 분석 결과 사용자 호스트 분자에 대 한 심사에 의해 막 복구 메커니즘의 복잡성의 그들의 지식을 확장 하는 기능을 제공 한다 또는 수리 하는 것 추가 화합물 멤브레인을 제어할 수 있습니다. 다음 프로토콜 LLO에 노출 하는 셀의 resealing 효율성을 측정 하는 실험 단계를 설명 하 고 특정된 약물 또는 resealing 효율성에 세포 치료의 효과 평가.

Protocol

1입니다. 준비 셀 도금참고: 인간 자 궁 경부 상피 세포, 헬러와 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP), 표현 헬러가이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나이 분석 결과 다른 포유류 세포19에 적용할 수 있습니다. 0.25% Trypsin EDTA의 2 mL와 함께 셀을 세척 하 여 75 cm는2 셀은 문화 플라스 크에서 부착 세포를 분리 합니다. 사용 된 트립 신을 2 mL 신선한 트립 신-EDTA 0.25%의 바꿉니다.<…

Representative Results

셀 계산 정확도: 헬러 세포 막 복구 메커니즘을 탐구 모델 포유류 세포 선으로 자주 사용 됩니다. 세포 인구 수준에서 막 복구를 평가할 때는 적절 한 데이터 해석에 대 한 모든 우물에 같은 농도에서 판 세포에 중요 하다. 그것은 또한 웰 스에서 핸드폰 번호는 해당 시험의 시간에 확인 해야 합니다. 헬러 세포 constitutively 히스톤 2B GFP (H2B-GFP) 융합을 표현 하는이 분석 결과?…

Discussion

이 분석 결과 막 셀 인구 수준 높은 처리량 용량 resealing의 효율성을 측정 합니다. 그것은 사용 될 수 있다 세포 구성 요소 또는 막 복구에 영향을 미칠 수 있는 약물 라이브러리에 대 한 화면으로. 기술된 분석 결과 96 잘 접시 형식을 사용 하지만 높은 처리량에 대 한 384-잘 접시를 적응 시킬 수 있다. 이 분석 결과의 장점은 과도 한 셀 셀 분리, 고정, 또는 형광 라벨 후 고정 등 처리에 대 한 필요 없?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 친절 하 게 우리 일부 예비 실험에 대 한 그의 멀티 모드 검색 플랫폼을 사용 하 수 있도록 박사 제시 Kwiek (오하이오 주립 대학)를 인정 합니다. 이 문서에서 보고 하는 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 스테파니 Seveau에 보너스 번호 RO1AI107250에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader Molecular Devices i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer Molecular Devices 5024062
TO-PRO-3 ThermoFisher Scientific T3605
Propidium Iodide ThermoFisher Scientific P3566
HeLa ATCC CCL2
HeLa H2B-GFP Millipore SCC117
Trypsin-EDTA 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate Corning 3603
Hanks' balanced Salts Sigma-Aldrich H4891
EGTA ISC BioExpress 0732-100G
HEPES Fisher Scientific BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax Sigma-Aldrich G5146-1KG

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Cite This Article
Lam, J. G., Song, C., Seveau, S. High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (143), e58351, doi:10.3791/58351 (2019).

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