High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Summary

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

Abstract

In hun fysiologische omgeving, zijn zoogdiercellen vaak onderworpen aan mechanische en biochemische benadrukt dat leiden beschadiging van het plasma membraan tot. In reactie op deze schadevergoeding verzegelen complexe moleculaire machines snel het plasma-membraan om te herstellen van de barrièrefunctie en handhaven van de overleving van de cel. Ondanks 60 jaar van onderzoek op dit gebied, wij nog steeds gebrek aan een grondige kennis van de cel opnieuw verzegelen van machines. Met als doel het identificeren van cellulaire componenten die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen of medicijnen die kunnen verbeteren opnieuw verzegelen, hebben we een fluorescentie-gebaseerde high-throughput assay dat maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen gekweekt in microplates. Als een modelsysteem voor plasmamembraan schade, de cellen worden blootgesteld aan de bacteriële porie-vormende toxine listeriolysin O (LLO), die grote 30-50 nm diameter eiwithoudende poriën in het cholesterol-bevattende vormt membranen. Het gebruik van een temperatuurgevoelig multi-mode microplate-lezer zorgt voor snelle en gevoelige spectrofluorometric metingen in combinatie met helderveld en fluorescentie microscopie beeldvorming van levende cellen. Kinetische analyse van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgestraald door een membraan impermeant nucleic zuur-bindende fluorescerende weerspiegelt de mate van membraan verwonding en opnieuw verzegelen op het celniveau bevolking, waardoor voor de berekening van de cel opnieuw verzegelen van efficiëntie . Fluorescentie microscopie imaging voorziet in de opsomming van cellen, die constitutively express een fluorescerende hersenschim van de nucleaire eiwit Histon 2B, in elk putje van de microplate om potentiële meetvariaties in hun aantal en zorgt voor eventuele identificatie van afzonderlijke cel populaties. Deze high-throughput assay is een krachtig hulpmiddel verwacht uit te breiden ons begrip van membraan herstelmechanismes via screening voor host genen of exogenously toegevoegd verbindingen die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen.

Introduction

Cellen van zoogdieren zijn onderworpen aan mechanische, osmotische en biochemische stress, wat resulteert in het verlies van plasma membraan integriteit. Zonder snelle en doeltreffende nieuwe sluiting, zou de beschadigde cellen snel bezwijken voor geprogrammeerde of necrotic dood. Sinds de jaren 1960, inspanningen te begrijpen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen proces voort uit de verwoestende gevolgen die verband houden met haar functioneringsproblemen. Inderdaad, ziekten zoals Limb-Girdle spierdystrofie, diabetes en Chediak-Higashi syndroom zijn gekoppeld aan gebrekkige plasmamembraan reparatie als gevolg van mutaties in het gen coderen dysferlin, productie van advanced glycation end producten en gebreken in de lysosomale mensenhandel regulator CHS1, respectievelijk^1,2,3,4,5,6. Tot op heden heeft ons begrip van membraan is opnieuw verzegelen echter nog beperkt⁷. Eerste studies hebben aangetoond dat membraan opnieuw verzegelen wordt geïnitieerd door de toestroom van extracellulaire Ca^{2 +} via de beschadigde plasmamembraan^8,9,10. Sindsdien verschillende niet-wederzijds exclusieve Ca^{2 +}-afhankelijke mechanismen zijn voorgesteld om het verzegelen van de cellen. De patch-hypothese stelt dat in de nabijheid van de wond, intracellulaire vesikels zekering met elkaar en de beschadigde plasmamembraan om op te treden als een patch^11,12,13,14. Een tweede model stelt dat calcium-afhankelijke exocytose van lysosomen op de wond site releases de lysosomale enzym zure sphingomyelinase, die sphingomyelinase naar ceramide in de buitenste bijsluiter van het plasma-membraan converteert. Deze plotselinge verandering in de samenstelling van lipide resultaten in ceramide gestuurde endocytose van de beschadigde regio^15,16,17. Tot slot betreft het derde voorgestelde mechanisme een rol voor de endosomal sorteren complexe vereist voor transport (ESCRT) ter bevordering van de vorming van naar buiten gerichte blaasjes die bud af van het plasmamembraan¹⁸. Slechts een beperkt aantal proteïnen werd geïdentificeerd in deze modellen, en hun machines moet verder worden opgehelderd.

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer assay die maatregelen het plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie in aanhangend zoogdiercellen onderworpen aan schade gemedieerd door recombinant listeriolysin O (LLO)¹⁹. LLO is een porie-vormende toxine (PFT) uitgescheiden door de facultatief intracellulaire pathogenen Listeria monocytogenes^20,21,22 en behoort tot de MACPF/CDC (membraan aanval complex, Perforine, en cholesterol-afhankelijke cytolyse) superfamilie. MACPF zijn zoogdieren porie-vormende eiwitten die betrokken zijn in de immuun afweer, overwegende dat de CDCs zijn voornamelijk bacteriële toxines geproduceerd door gram-positieve ziekteverwekkers die gastheer cellen beschadigen ter bevordering van hun pathogene levensstijlen²³. CDCs worden gesynthetiseerd als wateroplosbare monomeren of Dimeren die zich aan cholesterol binden presenteren in het plasma-membraan en oligomerize in een prepore complex van maximaal 50 subeenheden. De prepore complexe herschikt vervolgens als u wilt invoegen van β-strengen in de lipide dubbelgelaagde, vorming van een β-vat porie dat 30-50 nm in diameter^{24,25,26,27 omvat}.  Deze grote poriën toestaan fluxen van ionen en kleine cellulaire componenten binnen en buiten de cel; Sommige studies hebben echter voorgesteld dat de poriën van kleinere maten ook gevormde^{28,29,30 zijn}. LLO weergegeven onder de CDCs, unieke eigenschappen met inbegrip van bundeling van de onomkeerbare pH – en temperatuur-afhankelijke, die bevorderlijk is voor high-throughput analyses^31,32. LLO kan worden toegevoegd aan het kweekmedium cel op 4 ˚C, een temperatuur tolerant te zijn binding naar cellen, maar niet tot de vorming van de complexe porie. Inleiding van porie vorming kan vervolgens worden gesynchroniseerd door het verhogen van de temperatuur naar 37 ˚C, waardoor voor de efficiënte verspreiding van toxine moleculen in het vlak van het membraan te formulier oligomeren en de conformationele remodelleren die betrokken zijn bij de porie generatie. Dus, na de schakelaar in de temperatuur, de kinetische van celbeschadiging zal afhangen van de hoeveelheid toxine gebonden aan het plasma-membraan. Belangrijker, oplosbare LLO (niet gebonden aan het plasma-membraan) snel en onherroepelijk aggregaten wanneer de temperatuur 37 ˚C, die verlicht de noodzaak bereikt om het wegwassen van niet-afhankelijke toxine moleculen en beperkt de omvang van membraan schade na verloop van tijd. Tot slot, omdat LLO aan cholesterol bindt en poriën in cholesterol-rijke membranen vormt, deze test is vatbaar voor een breed scala van zoogdiercellen. Het is belangrijk om in gedachten houden dat LLO beïnvloedt gastheercel signalering hoofdzakelijk via de porie vorming, met een paar uitzonderingen na in welke cel porie-onafhankelijke signalering kan optreden^{33,34,35,36 ,37,38,39}. Daarom kunnen zij niet worden uitgesloten dat LLO signalering activiteiten invloed kunnen hebben op het proces van het membraan reparatie.

Deze test beoordeelt direct de mate van cel verwonding door het meten van de opneming van een cel impermeant fluorescerende (b.v., propidium jodide) dat passief gewonde cellen invoert en wordt sterk fluorescerende zodra gekoppeld aan nucleïnezuren . Vandaar, de fluorescerende kan worden gehandhaafd in het kweekmedium cel gedurende het gehele experiment, waardoor real-time analyses van cel verwonden. De intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof zal toenemen met de concentratie van toxine en, voor een bepaalde concentratie van toxine, zal toenemen in de tijd totdat alle poriën worden gevormd, en cellen volledig worden gerepareerd of verzadiging is bereikt. De toestroom van extracellulaire Ca^{2 +} via de poriën van het membraan is een conditio sine qua non -evenement voor opnieuw verzegelen. Daarom de resealing efficiëntie kan niet indirect worden aangetoond door het vergelijken van cel verwonding in kweekmedium dat Ca^{2 +} (reparatie tolerante voorwaarde) te verwonden in a Ca^{2 +}-gratis medium (reparatie beperkende voorwaarde). Omdat de intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof recht evenredig met de concentratie van de cel in elk putje is, is het belangrijk om zaad cellen op dezelfde concentratie in alle putjes. Het is ook belangrijk bij het inventariseren van de cellen in elk putje vóór en na de bepaling om ervoor te zorgen dat mobiele-detachement niet optreedt, als zwevende, geaggregeerde cellen kunnen verdoezelen fluorescentie lezingen die data interpretatie kunnen bemoeilijken. Om te inventariseren cellen, werden cellen uiten van nucleaire-gelokaliseerde Histon 2B-GFP (H2B-GFP) gebruikt in deze test. Temperatuurregeling, multi-mode, microplate lezers combineren snelle, hoge-doorvoer metingen (met behulp van een indeling van 96 of 384-well plaat) de intensiteit van de fluorescentie van met microscopie beeldvorming van levende cellen bij 37 ° C. De laatste kan worden gebruikt voor het opsommen van celaantal en observeren van de uiteindelijke vorming van afzonderlijke cel populaties.

Uiteindelijk, deze bepaling biedt gebruikers de mogelijkheid uit te breiden hun kennis van de complexiteit van membraan herstelmechanismes door screening voor gastheer moleculen of exogenously toegevoegde stoffen waarmee membraan kunnen repareren. Het volgende protocol worden de experimentele stappen beschreven voor het meten van de resealing efficiëntie van cellen die zijn blootgesteld aan LLO en de effecten van een bepaalde drug of cellulaire behandeling op opnieuw verzegelen efficiëntie evalueren.

Protocol

1. voorbereiding Cel PlatingOpmerking: Menselijke cervicale epitheliale cellen, HeLa en HeLa uiten Histone 2B-GFP (H2B-GFP), werden gebruikt in dit protocol, maar deze bepaling kan worden aangepast aan andere zoogdiercellen19. Loskoppelen Adherente cellen uit een 75 cm2 cel cultuur kolf door het wassen van de cellen met 2 mL trypsine-EDTA-0,25%. De gebruikte trypsine vervangen door 2 mL verse trypsine-EDTA 0,25%. Incubeer de cellen bij 37 ˚C gedurende 5…

Representative Results

Cel tellen nauwkeurigheid: HeLa cellen worden vaak gebruikt als een Modelgroep zoogdiercellen membraan herstelmechanismes verkennen. Bij de beoordeling van membraan reparatie op celniveau bevolking, is het belangrijk op plaat cellen op dezelfde concentratie in alle putjes voor de juiste data interpretatie. Het is ook belangrijk om te controleren op het moment van de bepaling dat cel nummers over wells gelijkwaardig zijn. HeLa cellen die constitutively express Histon 2B gesmolten tot GFP (…

Discussion

Deze test meet de efficiëntie van het membraan opnieuw verzegelen op celniveau bevolking met hoge gegevensdoorvoer capaciteit. Het kan worden gebruikt aan het scherm voor cellulaire componenten of drug-bibliotheken die invloed kunnen hebben op de membraan reparatie. De beschreven test gebruikt een 96-wells-plaat-indeling, maar het kan worden aangepast aan 384-Wells-platen voor hogere doorvoer. Een voordeel van deze test is de mogelijkheid om het verkrijgen van de fluorescentie metingen van aanhangend levende cellen in r…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG