We beschrijven een protocol om atherosclerose in de aorta hoofdmap van ApoE– / – muizen gevoed met een atherogene dieet, door middel van een continu release van aldosteron. Methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de plaque worden ook beschreven.
Atherosclerose is als gevolg van een chronische ontstekingsreactie beïnvloeden vasculaire endotheel en wordt bevorderd door een aantal factoren zoals hypertensie, dyslipidemia en diabetes. Tot op heden is er bewijs ter ondersteuning van een rol voor het circuleren van aldosteron als risicofactor voor de ontwikkeling van hart-en vaatziekten. Transgene muismodellen zijn gegenereerd om te bestuderen van cellulaire en moleculaire processen die leiden tot atherosclerose. In dit manuscript beschrijven we een protocol dat profiteert van continue infusie van aldosteron in ApoE– / – muizen en genereert atherosclerotische plaques in de aorta wortel na 4 weken van de behandeling. Wij daarom illustreren een methode voor de kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies op de aorta hoofdniveau. De toegevoegde waarde van aldosteron infusie wordt vertegenwoordigd door de generatie van atherosclerotische laesies rijk aan lipide en ontstekingscellen na 4 weken van de behandeling. We beschrijven in detail de kleuring procedures om te kwantificeren lipide en macrofaag inhoud binnen de plaque. Wij voeren in dit protocol, met name hart weefsel-insluiting in LGO om te behouden de antigenicity van cardiale weefsel en vergemakkelijken van detecteerbaarheid van antigenen van belang. Analyse van het fenotype van de plaque vormt een geldige benadering te bestuderen van de pathofysiologie van atherosclerose ontwikkeling en te identificeren van nieuwe farmacologische doelstellingen voor de ontwikkeling van anti-atherogene drugs.
Atherosclerose is een van de hoofdoorzaken van mortaliteit en morbiditeit wereldwijd1. Het wordt gekenmerkt door een chronische inflammatoire staat waar bloedvaten zijn geïnfiltreerd door lipiden en leukocyten die bepalend zijn voor de vorming van atherosclerotische plaques. Het merendeel van de acute cardiale evenementen worden geassocieerd met trombotische gebeurtenissen als gevolg van breuk van de plaque. Gevoelig voor scheuren plaques “kwetsbaar” worden gedefinieerd en worden gekenmerkt door verhoogde infiltratie van pro-inflammatoire leukocyten, een necrotische kern en een dunne vezelig cap2. In de laatste decennia, hebben klinische en experimentele studies verduidelijkt de complexe pathofysiologie van de ziekte. Verschillende dierlijke modellen worden gebruikt voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van atherosclerose3. De muis is momenteel de meest gebruikte soorten te bestuderen van atherosclerose ondanks sommige soortspecifieke verschillen in de pathofysiologie in vergelijking met de mens. In het bijzonder circuleert cholesterol bestaat voornamelijk door high-density lipoproteins (met antiatherogenic eigenschappen) in muismodellen, terwijl mensen circuleert cholesterol wordt voornamelijk vervoerd als low-density lipoproteins (LDL), waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom wild-type muizen geen spontane atherosclerose4 ontwikkelenvertegenwoordigen. Bovendien, wild type muizen in het algemeen resistent zijn tegen het absorberen van cholesterol uit de voeding, overwegende dat mens rond 50% van de dieetcholesterol4 absorberen. Deze beperkingen wilt opheffen, zijn verschillende genetisch gemodificeerde Muismodellen gegenereerd. Apolipoproteïne E-deficiente mouse (ApoE−/−) en LDL receptor-deficiente mouse (LDLr−/−) worden veel gebruikt. Op een hoog cholesterolgehalte van vetrijke dieet, ApoE−/− muizen ontwikkelen plaque meer snel in vergelijking met LDLr−/−muizen, en om deze reden is het gebruik van ApoE−/− muizen groter dan die van LDLr−/−muizen5,6. De beleidsverklaring−/− muizen ontwikkelen laesies in elk stadium van atherosclerose en vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij de mens, hoewel muis plaques geen een unstable fenotype7 vertonen. In het algemeen ApoE−/− muizen spontaan ontwikkelen atherosclerose en dit proces wordt versneld met een westerse dieet3. De ernst van atherosclerose kan worden geëvalueerd op het niveau van de halsslagader, pulmonale, femorale slagader van de brachiocephalic en de aorta wortel6. In het bijzonder vertegenwoordigt de aorta hoofdmap een anatomische site gevoelig voor het ontwikkelen van atherosclerotische laesies in muizen. Om deze reden is het gebruikelijk om te evalueren van de vorming van atherosclerotische plaques in deze regio.
Verschillende studies hebben aangetoond dat aldosteron is betrokken bij de ontwikkeling van atherosclerose8,9,10. Aldosteron infusie in ApoE−/− muizen gevoed een atherogene dieet versnelt de ontwikkeling van atherosclerotische laesies aorta wortel ontstoken en lipide-rijke plaque vorming10inducerende.
In samenvatting beschrijven we een protocol met inbegrip van aldosteron infusie, atherogene dieet voeding, inbedding van hart weefsels, kwantificering en karakterisering van atherosclerotische laesies in ApoE– / – muizen. Deze procedure bevordert een efficiënte vorming van ontstoken, lipide-rijke atherosclerotische plaques en een waardevol model voor de studie van atherogenese vertegenwoordigt.
Atherosclerose is een chronische inflammatoire aandoening die is gekoppeld aan grote en middelgrote schepen met interacties tussen meerdere celtypen, zoals macrofagen, T-lymfocyten, endotheliale cellen en vlotte spier cellen1. Ondanks de beperkingen van lymfkliertest atherogene modellen is een groot lichaam van bewijsmateriaal op de atherosclerotische proces beschikbaar. Deze modellen hebben het voordeel van snel genereren van experimentele cohorten van een bepaalde leeftijd en geslacht. Muizen oo…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door subsidies van het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 en PE-2011-02347070 naar M.C.)
Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |