يصف لنا وضع بروتوكول للحث على تصلب الشرايين في جذر الابهر الذين–/– الفئران التي تتغذى على نظام غذائي atherogenic، من خلال إصدار مستمر من الدوستيرون. ويرد أيضا أساليب لتحديد خصائص تكوين اللوحة.
تصلب الشرايين هو سبب استجابة التهابات مزمنة التي تؤثر على بطانة الأوعية الدموية وروجت عدة عوامل مثل ارتفاع ضغط الدم، ودسليبيدميا، ومرض السكري. وحتى الآن، هناك أدلة لدعم دور لتعميم الدوستيرون كعامل خطر لتطوير مرض القلب والأوعية الدموية. تم إنشاؤها نماذج الماوس المحورة وراثيا دراسة العمليات الجزيئية والخلوية، مما يؤدي إلى تصلب الشرايين. في هذه المخطوطة، يصف لنا بروتوكول الذي يستفيد من التسريب المستمر الدوستيرون في الفئران الذين-/- ويولد لويحات تصلب الشرايين في جذر الابهر بعد 4 أسابيع من العلاج. ولذلك، نحن، توضيح طريقة للقياس الكمي وتوصيف للآفات تصلب الشرايين على مستوى جذر الاورطي. تمثل القيمة المضافة لضخ الدوستيرون جيل آفات تصلب الشرايين الغنية بالدهون والخلايا الملتهبة بعد 4 أسابيع من العلاج. يصف لنا بالتفصيل الإجراءات المصبوغة التحديد الكمي لمحتوى الدهن وبلعم داخل اللوحة. جدير بالذكر أن في هذا البروتوكول، نقوم بقلب تضمين الأنسجة في أكتوبر من أجل الحفاظ على أنتيجينيسيتي أنسجة القلب وتيسير إمكانية الكشف عن المستضدات للفائدة. تحليل النمط الظاهري اللوحة يمثل نهجاً صحيحاً لدراسة الفسيولوجيا المرضية للتنمية تصلب الشرايين وتحديد الأهداف الدوائية رواية لتطوير الأدوية المضادة أثيروجينيك.
تصلب الشرايين أحد الأسباب الرئيسية للوفيات والإصابة بالأمراض في جميع أنحاء العالم1. ويتميز بدولة التهاب مزمن حيث تكون الأوعية الدموية تسلل الدهون والكريات البيضاء التي تحدد تشكيل لويحات تصلب الشرايين. معظم الأحداث القلبية الحادة المرتبطة بأحداث الخثاريه بسبب تمزق اللوحة. يتم تعريف “الضعيفة” لويحات المعرضة للتمزق وتتميز بزيادة تسلل الكريات البيضاء برو التحريضية، ونواة نخرية، و كاب ليفية رقيقة2. في العقود الماضية، وقد أوضحت الدراسات السريرية والتجريبية الفسيولوجيا المرضية المعقدة للمرض. وتستخدم عدة نماذج حيوانية للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تشارك في تنظيم دورات تعريفية لتصلّب الشرايين3. حاليا، هو الماوس الأنواع الأكثر استخداماً لدراسة تصلب الشرايين وعلى الرغم من بعض الاختلافات إبلاغها الموجودة في الفيزيولوجيا المرضية، بالمقارنة مع البشر. على وجه الخصوص، تعميم الكولسترول يتكون أساسا من البروتينات الدهنية الكثافة (مع خصائص أنتياثيروجينيك) في نماذج الماوس، بينما البشر تعميم الكولسترول أساسا هو نقل ك low-density البروتينات الدهنية (LDL)، ربما تمثل السبب الرئيسي لماذا لا تتطور الفئران البرية من نوع تصلب الشرايين عفوية4. وعلاوة على ذلك، الفئران نوع البرية عموما مقاومة لامتصاص الكولسترول من الغذاء، بينما البشر تستوعب حوالي 50% من الكولسترول الغذائي4. للتغلب على هذه القيود، تم إنشاؤها عدة نماذج الماوس المعدلة وراثيا. وتستخدم على نطاق واسع الابوليبوبروتين ه – نقص الماوس (الذين−/−) والماوس – تفتقر إلى مستقبلات LDL (لدلر−/−). على حمية عالية الدهون ارتفاع الكولسترول، الفئران− −/الذين وضع اللوحة أكثر سرعة بالمقارنة مع الفئران−−/لدلر، ومن لهذا السبب، يتم استخدام الفئران− −/الذين أكثر انتشارا من أن لدلر−/−الفئران5،6. الفئران− −/الذين وضع الآفات في أي مرحلة من تصلب الشرايين، وهي مماثلة لتلك التي لوحظت في البشر، وعلى الرغم من أن لا تظهر لويحات الماوس النمط الظاهري غير مستقرة7. عموما، الذين−/− الفئران عفويا تطوير تصلب الشرايين وهو التعجيل بهذه العملية مع النظام غذائي غربي3. ويمكن تقييم شدة تصلب الشرايين على مستوى الشريان براتشيوسيفاليك، السباتي، الرئتين، والفخذ و جذر الاورطي6. على وجه الخصوص، يمثل جذر الاورطي موقع تشريحي عرضه لتطوير الآفات تصلب الشرايين في الفئران. ولهذا السبب، ممارسة شائعة لتقييم تشكيل لويحات تصلب الشرايين في هذه المنطقة.
لقد بينت دراسات عديدة أن الدوستيرون المتورطة في تطوير تصلب الشرايين8،،من910. ضخ الدوستيرون في الفئران− −/الذين تغذت atherogenic يسرع تطوير جذر الاورطي آفات تصلب الشرايين الذي يحفز تشكيل اللوحة ملتهبة والغنية بالدهون10.
وباختصار، نحن وصف بروتوكول بما في ذلك ضخ الدوستيرون، atherogenic حمية تغذية، والتضمين من أنسجة القلب، والتقدير الكمي وتوصيف للآفات تصلب الشرايين في الفئران الذين-/ . هذا الإجراء يعزز تشكيل لويحات تصلب الشرايين الملتهبة، والغنية بالدهون كفاءة، ويمثل نموذجا قيماً لدراسة أثيروجينيسيس.
تصلب الشرايين اضطراب التهابات مزمنة المرتبطة بالسفن الكبيرة والمتوسطة الحجم التي تنطوي على تفاعلات بين العديد من أنواع الخلايا، مثل الضامة اللمفاويات T وخلايا بطانية و خلايا العضلات الملساء1. على الرغم من محدودية موريني نماذج atherogenic، تتوفر مجموعة كبيرة من الأدلة على أن عملي?…
The authors have nothing to disclose.
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الصحة الإيطالية (كورينتي ريشيركا وغرام-2009-1594563 بي-2011-02347070 لمولودية)
Adjusted calories diet (42 % from fat) | Envigo | TD.88137 | atherogenic diet |
Osmotic minipump with filling tube | Alzet | model 1004 | for continous realase |
Aldosterone | SIGMA | A9477 | hormone |
Ethanol | SIGMA | 34852-M | solvent |
Alchol Preps saturated with 70 % Isopropyl Alcohol | Kendal Webcol | 6818 | Disinfectant |
Surgery wire (Vicryl 6.0) | Demas | 500004 | surgery |
10% Povidone/iodine ointment | Aplicare-Meriden | 52380-0026-1 | Antiseptic |
Formalin 10% | SIGMA | HT5012 | to fix vascolature |
Cryomold | Bio-Optica | 07-MP1515 | for embedding |
O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | for embedding |
Cryostat | Leica | CM1900 | instrument for sectioning |
Dulbecco's Phosphat Buffered Saline | Aurogene | AU-L0615-500 | buffer solution |
Adhesion Slides Polysine | VWR | 631-0107 | microscope glasses |
Cover Glasses | Bio-Optica | 72015 | cover glasses |
Formaldehyde 37% | SIGMA | 252549 | solvent |
Oil Red O solution (0.5 % in isopropanol) | SIGMA | O1391 | staining solution |
Mayer’s Hematoxylin | SIGMA | MHS32 | staining solution |
Lithium Carbonate | SIGMA | 62470 | washing buffer |
Acqueous Mounting Medium | Thermo Scientific | TA-125-AM | mounting solution |
Acetone | SIGMA | 179124 | solvent |
Phosphomolybdic acid solution | SIGMA | HT153 | for hystology |
Direct Red 80 (Picrosirius Red) | SIGMA | 365548 | staining solution |
Bio Clear (clearing agent of terpene origin) | Bio-Optica | 06-1782D | product for the preparation of histological samples |
Eukitt Quick Hardening mounting medium (Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | SIGMA | 3989 | mounting solution |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fluka | 71725 | powder |
Hydrogen Peroxide solution (30 %) | SIGMA | H1009 | solution |
Vectorstain ABC KIT including: anti-rabbit IgG ABC, normal rabbit serum, Secondary-biotinylated Anti-Rat IgG , | Vector Laboratories | PK-6100 | staining solution |
3-amino-9-ethylcarbazole | Vector Laboratories | SK-4200 | staining solution |
Mac3 antibody | BD Biosciences | 553322 | antibody |
ImagePro Premier 9 | Media Cybernetics | 050910000-2534 | software to analyze images |