כאן מוצג פרוטוקול לחקור את ההשפעות המוקדמות של עמילואיד-β (Aβ) במוח. זה מראה Aβ גורם אנדוציטוזה בתיווך clathrin וכיווץ של צמיחת עצב קונוסים. הפרוטוקול שימושי בלימוד ההשפעות המוקדמות של Aβ על צמיחת עצב קונוסים, עשוי להקל על מניעת מחלת אלצהיימר.
עמילואיד-β (Aβ) גורמת ליקויי הזיכרון מחלת אלצהיימר (AD). למרות הרפוי הוכחו להפחית את רמות Aβ במוחם של חולי אלצהיימר, אלה לא לשפר זיכרון פונקציות. מאז Aβ אגרגטים במוח לפני הופעתו של ליקויי הזיכרון, מיקוד Aβ עשוי להיות יעיל לטיפול בחולי לספירה אשר כבר תערוכת זיכרון גירעונות. לכן, איתות במורד הזרם עקב Aβ התצהיר לחסום לפני פיתוח לספירה. Aβ גורם ניוון עצב, שמוביל שיבוש רשתות עצביים, ליקויי הזיכרון. למרות שיש מחקרים רבים על המנגנונים רעילות Aβ, המקור של רעילות Aβ נותר עלום. כדי לסייע בזיהוי המקור, אנו מציעים הרומן פרוטוקול העושה שימוש במיקרוסקופ ג’ין תרביות תאים, תא חי הדמיה כדי לחקור מוקדם השינויים שנגרמו על ידי Aβ ב צמיחת עצב קונוסים של נוירונים בתרבית. פרוטוקול זה חשף כי Aβ המושרה בתיווך clathrin אנדוציטוזה בתוך גביעי צמיחת עצב ואחריו התמוטטות חרוט הצמיחה, הוכחת כי עיכוב של אנדוציטוזה מונעת Aβ רעילות. פרוטוקול זה יהיה שימושי ללמוד את ההשפעות המוקדמות של Aβ, עלול להוביל יותר יעיל, מונעת טיפול לספירה.
משקעי עמילואיד-β (Aβ) נמצאים במוח של חולי מחלת אלצהיימר (AD) והם נחשבים מטרה קריטית לספירה1 לשבש רשתות עצביים, המוביל אל זיכרון ליקויי2,3,4. מועמדים סמים קליניים רבים הוכחו יעיל למנוע ייצור עמילואיד-β (Aβ) או להסיר משקעים Aβ. עם זאת, איש לא הצליח לשיפור הזיכרון הפונקציה ב- AD חולים5. Aβ כבר נצבר במוח לפני תחילתה של ליקויי זיכרון6; לכן, הפחתת רמות Aβ במוחם של חולי מפגין ליקויי הזיכרון עשוי להיות לא יעיל. Aβ התצהיר נוכחת חולי אלצהיימר פרה; עם זאת, חולים אלו להציג רק לעתים רחוקות עצביים ניוון וזיכרון גירעונות6. יש פער-זמן בין התצהיר Aβ ליקויי הזיכרון. לכן, אסטרטגיה קריטי למניעת לספירה חוסם רעילות Aβ איתות כבר בשלבים המוקדמים של AD, לפני הפיתוח של זיכרון גירעונות. Aβ התצהיר המניע האקסון ניוון7,8,9,10,11,12,13, דבר שעלול להוביל לשיבוש רשתות עצביות, ליקוי הקבע של פונקציית הזיכרון. מחקרים רבים חקרו את המנגנונים רעילות Aβ; לדוגמה, האקסונים מנוונת של המוח עכברים לספירה הוכחו הגדילו autophagy14. הפעלת Calcineurin דווחה כמנגנון אפשרי של Aβ-induced ניוון עצב15; עם זאת, הגורם הישיר של ניוון עצב נותר עלום.
מחקר זה מתמקד ההתמוטטות של קצות עצב הנקרא צמיחה קונוסים. נפילת קונוסים צמיחת עצב יכול להיגרם על ידי דוחי צמיחת עצב, כגון semaphorin-3A ו- ephrin-A516,17,18,19,20. קצות עצב dystrophic כמו התמוטטות נצפו במוחם של המודעה חולים21,22. בנוסף, כישלון של תפקוד חרוט הצמיחה יכול לעורר ניוון עצב23. עם זאת, לא ידוע אם Aβ גורם לקריסת חרוט הצמיחה. לפיכך, מחקר זה מציג פרוטוקול הרומן לבחון את ההשפעות המוקדמות של Aβ בנוירונים בתרבית ולחקור התמוטטות חרוט הצמיחה הנוצרות על-ידי Aβ.
הפרוטוקול המתוארים במחקר זה מאפשר התבוננות תופעות בראשית צמיחת עצב קונוסים לאחר טיפול Aβ1-42. Aβ1-42 המושרה אנדוציטוזה ב צמיחת עצב קונוסים בתוך 20 דקות, התמוטטות חרוט הצמיחה נצפתה בתוך h 1 של הטיפול. אנדוציטוזה הזה היה כנראה בתיווך clathrin. באמצעות פרוטוקול זה, עיכוב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin אושר ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומן בחלקו על ידי מענקי מחקר של JSPS (KAKENHI 18K 07389), יפן, טקדה למדע, יפן ו קוביאשי פרמצבטיקה ושות’, בע מ, יפן.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |